柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建.pdfVIP

湖南农业大学学报(自然科学版) 2017, 43(2):140–144. DOI:10.13331/ki.jhau.2017.02.005 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) 投稿网址： 柑橘衰退病毒基因 RNAi 载体的构建 李芳 1,2，邓子牛 1,2，赵亚 1,2，李大志 1,2，戴素明 1,2* (1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128 ；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南 长沙 410128) 摘 要：基于转化病毒基因介导抗性，通过在植物表达载体 pCAMBIA 2301 上插入启动子–内含子–终止子的方 式，构建一种含有发夹结构的、通用型强的 RNAi 载体骨架结构；以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus, CTV)的 p25 、 p20 和p23 基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段，先后与骨架载体连接，成功构建了 3 个 RNAi 载体(分 别命名为ds2301–p25、ds2301–p20 和 ds2301–p23)，并将载体 ds2301–p23 注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23 基因 的地高辛标记探针，用 Northern 杂交检测是否有 siRNA 产生。结果表明：用 Northern 杂交可以检测到 p23 特异 的 siRNA，在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌 ds2301–p23 可以发生 RNAi，表达有效的 siRNA。本研究中构 建的骨架载体可以广泛用于 RNAi 载体的构建，含有柑橘衰退病毒基因片段的 3 个载体可以用于基因功能分析及 具有 CTV 抗性的柑橘种质资源获得。 关 键 词：柑橘；柑橘衰退病毒；RNAi 载体；载体构建 中图分类号：Q946.8 文献标志码：A 文章编号：1007− 1032(2017)02−00140−05 Construction the RNAi vector for virus genes of Citrus tristeza LI Fang1,2, DENG Ziniu1,2, ZHAO Ya1,2, LI Dazhi1,2, DAI Suming1,2* (1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.National Center for Citrus Improvement Changsha, Changsha 410128, China) Abstract: According to the pathogen–derived resistance, a framework of a universal RNAi vector with hairpin structure was constructed by inserting a CaMV35s promoter–intron–terminator into a plasmid of pCAMBIA 2301. By adopting the conservation sequence of virus gene p25, p20 and p23 in Citrus tristeza as templates, three RNAi vectors, including ds2301–p25, ds2301–p20 and ds2301–p23, were separately obtained through inserting three