猪圆环病毒2型重组病毒ZJ—R感染性克隆的构建.pdfVIP

第 35卷 第2期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol_35 No．2 2016年 3月 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Mar,．2016．97～ 100 猪 圆环病毒 2型重组病毒 ZJ—R感染性克隆的构建 温立斌 张 丹 何孔旺 解建平 董美响 1．江苏省农业科学院兽医研究所 ／农业部兽用生物制品工程技术重点实验室／ 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014； 2．河北省饲料工业协会 ，石家庄 050021 摘要 利用无缝克隆方法构建 ZJ—R全长基因组的单拷贝分子克隆以及双拷贝串联分子克隆；通过生物信 息学技术预测 rZJ—R病毒结构蛋 白的B细胞抗原表位，人工合成选定的表位肽，然后偶联KLH免疫新西兰大白 兔制备多克隆抗体；免疫组化试验证实该多抗与转染 PK15细胞的 一R双拷贝串联分子克隆具有反应性。结 果表明构建的 一R双拷贝串联分子克隆具有感染性。 关键词 猪圆环病毒2型重组病毒 一R；无缝克隆；B细胞表位；肽抗体 ；感染性克隆 中图分类号 S852．65 文献标识码 A 文章编号 1000—2421(2016)02-一0097-一04 猪圆环病毒2型 (PCV2)被认为是猪圆环病毒 控研究室保存；GBclonart无缝组装试剂盒为上海 相关疾病(PCVAD)的必要病原l1屯]。PCVAD包括 诺 晶生物科技有限公司产品；DNA片段胶回收试剂 临床常见的猪断奶后多系统衰竭综合征 (PMWS)、 盒及质粒提取试剂盒为AxyGen产品；转染试剂 Ii— 猪皮炎与肾病综合征 (PDNS)，也包括繁殖障碍、呼 pofectamineTM2000为 Invitrogen产品；弗氏完全佐 吸道疾病等。此外，PCV2还可引起机体免疫抑制， 剂和弗氏不完全佐剂为Giffico产品；匙空血蓝蛋白 容易导致 继发感染和免疫失败。目前，单纯用 (KLH)为 Sigma产品；SABC-AP免疫组化染色试 PCV2感染动物很难复制出典型的临床症状，许多 剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；RPMI-一 学者认为还有其他未知因子与PCV2共同起作用。 1640培养基及胎牛血清购 自GIBCO公司。新西兰 我们前期陆续发现了2株PCV2重组病毒一P1和 大 白兔来 自南京市江宁区青龙山动物繁殖场 。 P2，它们可能是PCV2与其他病毒基因组重组形成 1_2 引物及多肽 的_3]。最近 ，我们报道了PCV2与宿主基因组重组 所有试验用引物和多肽均 由南京金斯瑞生物科 形成的ZJ—R病毒 (GenBank登录号KM259933)，同 技有限公司合成 。 P1和P2一样，ZJ—R病毒也具有闭合环状DNA基 1．3 ZJ．R基因组单拷贝分子克隆和双拷贝串联分 因组_5]。本研究旨在构建 ZJ—R病毒的感染性克隆， 子克隆的构建 为进一步研究 ZJ—R病毒的生物学特性 以及其在 按照 GBclonart无缝组装试剂盒说 明，进行 PCV2致病过程中扮演的角色奠定基础 。 ZJ—R病毒基因组分子克隆的构建。重组反应体系 为 20 L，包括 2×Gbclonart无缝组装反应液、线性 1 材料与方法 化的pSK载体(EcoRV酶切消化)、PCR片段 1或／ 1．1 载体、细胞、试剂及试验动物 和 PCR片段 2、双蒸水；经 45℃孵育 30min后，进 pBluescriptSK(pSK)载体、ZJ—R全基 因组的 行转化，涂 LB平板，挑取菌落 PCR阳性克隆进行 pMD18一T载体以及无PCV1和PCV2污染的PK15 测序证实。其中用于构建 ZJ—R单拷贝分子克隆的 细胞由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防 PCR片段 1的1对扩增引物为： F：5-GGTATCGATAAGCTTGATTCCCGCK3GGAAC