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微生物实验报告2012054015杨小静精要
脓汁和粪便标本中病原菌的分离培养与检测
专业:中西医临床医学七年制 学号:2012054015 姓名:杨小静
实验目的:本次脓汁粪便标本中病原微生物的检测实验,旨在通过培养基制备,病原菌的分离与培养,以及细菌鉴别实验如革兰氏染色法,血浆凝固酶试验,药敏试验,半固体接种法实验,从而对医学微生物学主要的研究方法和手段有一定程度的了解,初步掌握微生物试验的基本技能和原理,也有助于无菌观念的树立。
1.实验器材:
接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、 生物显微镜、电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管(棉塞)、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子
2.实验方法与步骤:①培养基的制备 ②细菌的分离培养③细菌的纯培养④细菌的形态学检查 ⑤细菌的生化试验等⑥细菌的血清学试验、结果
第一次实验
2.1培养基的制备、消毒和灭菌
如下图表格内容要求所示制备培养基。
表一
组号 培养基 称量
(g) 水量
(ml) 煮沸
(次) 分装
(ml) 备注(40人份) 1 营养琼脂 11.4 300 ? ? 4瓶,500ml瓶,平板 2~4 营养琼脂 2.9 75 3 5 15支×3,中试管,斜面 5~7 营养肉汤 1.1 50 1 3 15支×3,小试管,液体 8~10 半固体 1.9 50 3 3 15支×3,小试管,高层 第二次实验
2.1手指和空气的细菌学检查
实验步骤:1空气的细菌学检查:每组1个营养琼脂平板,选择采样地点(实验室、卫生间或任选地点),将平板盖打开,盖朝下放置在平板旁边,平板暴露于空气中15分钟,然后平板倒扣盖上,作标记。37℃温箱培养24小时,观察结果。(※ CFU/m3 = 50000N÷AT≈86N(直径7cm平板)。N:平板上的菌落数。A:平板面积(平方厘米)。T:采样时间(分钟)。
CFU /m3 = 50,000N÷AT ≈8333
2手指皮肤的细菌学检查:
上:甲、丙→常规洗手 甲和乙、丙和丁共用1个平板
下:乙、丁→标准洗手
第1格为洗手前,
第2格为洗手后,
第3格为消毒后,
第4格空白对照
在培养基表面触摸2~3厘米
手指皮肤细菌检查结果分析
比较洗手前后细菌的种类。
洗前细菌种类多。
洗后细菌种类少。
洗手能洗掉大多数暂住菌。
比较常规和标准洗手的细菌数量。
常规(简单)洗手,平板上细菌数量少。
标准洗手,平板上细菌数量多。原因:常住菌数量大,牢固附着在皮肤上,常洗不掉, 可洗松动,经摩擦接种、脱落到培养基上,显示细菌更多
碘酒和酒精棉球消毒以后没有细菌生长。
空白对照有没有细菌生长。
第三次实验
2.2细菌的分离与培养
2.2.1采用平板划线分离法,取脓汁标本在普通平板表面划线,取粪便标本在伊红美蓝固体培养基表面划线,使之分散成单个细菌,在37℃培养18~24h ,从而分离出单个菌落。
小组实验分工
甲→脓汁标本(pus specimen)→营养琼脂平板(nutrient agar plate)
乙→脓汁标本(pus specimen) →营养琼脂平板(nutrient agar plate)
丙→粪便标本(stool specimen)→伊红美蓝(eosin methylene blue plate)
丁、戊→粪便标本(stool specimen) →伊红美蓝平板(EMB plate)
2.2.2观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色。
第四次实验
2.2.3细菌的纯培养:
取脓汁标本在普通平板上的黄色、白色单菌落,粪便标本在伊红美蓝平板上的紫黑色、淡粉红色单菌落接种在四个斜面培养基,标记,在37℃培养18h。
注意事项:
从斜面上取菌时,一般只取半个小菌落大小的菌量;接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。
2.3细菌个体形态特征的观察
2.3.1革兰染色法观察细菌形态。
涂片的制备
甲→金黄,紫黑。乙→白色,粉红。
丙→金黄,紫黑。丁→白色,粉红。
、
①手持载玻片一端,涂膜朝上,两个涂膜快速通过火焰外层3次,时间2~3秒钟。
②促使菌体蛋白质凝固,固定在载玻片上,以免染色水洗的时候,细菌被水洗掉。
染色:结晶紫 → 初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟→水洗稀释→复红→复染1分钟→水洗→吸干,镜检。
革兰阳性菌 革兰阴性菌
图片分析:1用普通平板,从浓汁标本中分离得到金黄、白色两种菌落,这两株细菌,显微镜油镜下均为G+球菌,排列不规则,呈葡萄串状,是典型的葡萄球菌。结合菌落色素,这两株葡萄球菌
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