微生物实验报告2012054015杨小静.doc

脓汁和粪便标本中病原菌的分离培养与检测 专业：中西医临床医学七年制 学号：2012054015 姓名：杨小静 实验目的：本次脓汁粪便标本中病原微生物的检测实验，旨在通过培养基制备，病原菌的分离与培养，以及细菌鉴别实验如革兰氏染色法，血浆凝固酶试验，药敏试验，半固体接种法实验，从而对医学微生物学主要的研究方法和手段有一定程度的了解，初步掌握微生物试验的基本技能和原理，也有助于无菌观念的树立。 1.实验器材： 接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、 生物显微镜、电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子 2.实验方法与步骤：①培养基的制备 ②细菌的分离培养③细菌的纯培养④细菌的形态学检查 ⑤细菌的生化试验等⑥细菌的血清学试验、结果 第一次实验 2.1培养基的制备、消毒和灭菌 如下图表格内容要求所示制备培养基。 表一 组号 培养基 称量 (g) 水量 (ml) 煮沸 (次) 分装 (ml) 备注（40人份） 1 营养琼脂 11.4 300 ? ? 4瓶，500ml瓶，平板 2～4 营养琼脂 2.9 75 3 5 15支×3，中试管，斜面 5～7 营养肉汤 1.1 50 1 3 15支×3，小试管，液体 8～10 半固体 1.9 50 3 3 15支×3，小试管，高层 第二次实验 2.1手指和空气的细菌学检查 实验步骤：1空气的细菌学检查：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中15分钟，然后平板倒扣盖上，作标记。37℃温箱培养24小时，观察结果。（※ CFU/m3 ＝ 50000N÷AT≈86N(直径7cm平板）。N：平板上的菌落数。A：平板面积(平方厘米)。T：采样时间(分钟)。 CFU /m3 ＝ 50,000N÷AT ≈8333 2手指皮肤的细菌学检查： 上:甲、丙→常规洗手 甲和乙、丙和丁共用1个平板 下:乙、丁→标准洗手 第1格为洗手前， 第2格为洗手后， 第3格为消毒后， 第4格空白对照 在培养基表面触摸2～3厘米 手指皮肤细菌检查结果分析 比较洗手前后细菌的种类。 洗前细菌种类多。 洗后细菌种类少。 洗手能洗掉大多数暂住菌。 比较常规和标准洗手的细菌数量。 常规（简单）洗手，平板上细菌数量少。 标准洗手，平板上细菌数量多。原因：常住菌数量大，牢固附着在皮肤上，常洗不掉， 可洗松动，经摩擦接种、脱落到培养基上，显示细菌更多 碘酒和酒精棉球消毒以后没有细菌生长。 空白对照有没有细菌生长。 第三次实验 2．2细菌的分离与培养 2.2.1采用平板划线分离法，取脓汁标本在普通平板表面划线，取粪便标本在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。 小组实验分工 甲→脓汁标本(pus specimen)→营养琼脂平板(nutrient agar plate) 乙→脓汁标本(pus specimen) →营养琼脂平板(nutrient agar plate） 丙→粪便标本(stool specimen)→伊红美蓝(eosin methylene blue plate） 丁、戊→粪便标本(stool specimen) →伊红美蓝平板(EMB plate） 2.2.2观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色。 第四次实验 2.2.3细菌的纯培养： 取脓汁标本在普通平板上的黄色、白色单菌落，粪便标本在伊红美蓝平板上的紫黑色、淡粉红色单菌落接种在四个斜面培养基，标记，在37℃培养18h。 注意事项： 从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。 2.3细菌个体形态特征的观察 2.3.1革兰染色法观察细菌形态。 涂片的制备 甲→金黄，紫黑。乙→白色，粉红。 丙→金黄，紫黑。丁→白色，粉红。 、 ①手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。 ②促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。 染色：结晶紫 → 初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗稀释→复红→复染1分钟→水洗→吸干,镜检。 革兰阳性菌 革兰阴性菌 图片分析：1用普通平板，从浓汁标本中分离得到金黄、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌