红细胞膜蛋白提取流程.pptVIP

红细胞膜蛋白提取鉴定 内容 1. 红细胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量测定（Lowry法） 3.膜蛋白电泳分离、分子量测定 SDS.western blotting 鉴定β-actin 一.红细胞膜提取制备（低渗法） 原理： RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血 －－溶血液。 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和其它内含物，制得纯净的RBC膜－－称为血影 “ghost” 注意事项： 1.离心步骤一定要“平衡、对称放置” 2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜” 3. 缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加 4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白脱落，1mMCaCl2可防止此种膜的不稳定性。 5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性，应在4?C离心。 （1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟×2 洗净之RBC （2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸buffer（1:50) (在 烧杯中） 稍搅拌 置冰箱冻格（4?C）溶血过夜 （以上步骤已完成！！） 二、 RBC膜纯化（洗涤） 三、 样品处理： 1.SDS用样品处理（一大组）： 0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5’ 2.Lowry法测定用样品处理 (3-4 人/group）： A. 取0.3ml RBC原液＋ 1.5ml H2O＋ 150ul NaOH 沸水浴 5’ 待测管1： 取A液0.1ml＋0.9ml H2O 待测管2： 取A液0.3ml＋0.7ml H2O 四、Lowry法测定膜蛋白含量 立即摇匀，放置15分钟。以第６管为空白管，在分光光度计上以620ｎｍ比色，读取Ａ。 以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。 2.红细胞膜样品蛋白含量的测定 将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定 　 作图： 横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以A620吸光度值 图比例应为3:2（横：纵） 计算： 在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算 提取膜的 Pr mg数/ml样品 注意稀释倍数 要求：计算原提取RBC液的Pr含量 五、SDS测定膜蛋白分子量 不连续电泳系统： 电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应） （一）垂直板安装 每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！ （二）凝胶制备（见表） 先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其凝固后，再配浓缩胶。 （三）电泳装置安装 先装内槽，试无渗漏； 放入外槽中，加Buffer。 上样品： 每孔18ul，2块/组 每块板留一标准蛋白孔 （四） 电泳： 100V进分离胶调至80V 约1.5小时 （五）取胶: 用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。 注意： 一块半干转移（浸入转移Buffer20min） 另一块考马斯亮蓝染色 染色2小时后，7%醋酸脱色（×4） 每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。 分子量计算 1.测量： cm a.每条带距离 （起始点至带中心） b.起始至示踪