细菌的简单染色和革兰氏染色.pptVIP

实验一 细菌的染色 尹会方 2012.3.12 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 1. 学习掌握简单染色的操作技术和无菌操作技术。 2. 理解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。 3.了解芽孢染色机理，掌握芽孢染色的方法。 二、实验原理---简单染色 细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 二、实验原理---简单染色 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。 二、实验原理---革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。 二、实验原理---革兰氏染色 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。 二、革兰氏染色机理 当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。。 三、实验器材 1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌种。 2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。 3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶（香柏油和二甲苯）。 四、实验方法和步骤 细菌的简单染色 1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。 2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。 四、实验步骤 1、菌落形态观察： 2、细菌简单染色： 3、细菌革兰氏染色。 2. 革兰氏染色 1）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/4处下面用记号笔分别标明S和E（见图示），并滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。 2. 革兰氏染色 2、干燥与固定：方法同（一）中2，3步骤 3、染色： 结晶紫染色1-2分钟--水洗--碘液媒染1-2分钟--水洗--酒精脱色15-20秒--水洗--番红复染色2-3分钟--水洗--干燥--镜检记录。 注意事项： ①酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。②被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。 染色结果 染色