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本科学生综合性实验报告 光合色素的提取、理化性质 分离、吸收光谱及含量的测定 学号： 134120171 姓名： 王晓莲 学院： 生命科学学院 A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2 由于K是一个常数，而A可以通过分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。 k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为： ε——摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为： 实验设备及材料 材料 新鲜植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂、20%KOH甲醇溶液、苯、 自来水、50%醋酸、醋酸铜、启动剂、80%丙酮 实验设备 试管、滤纸、研钵、玻璃棒、锥形瓶、剪刀、移液管、洗耳球、烧杯、 漏斗、离心机、便携式叶绿素测定仪、分光光度计、天平、离心管、 滴管 4．实验步骤 Ⅰ光合色素的提取与理化性质 （1）光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 （2）观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。 （3）光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。 （4）皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。 （5）取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。 II 光合色素的分离与吸收光谱 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素→ 启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1 吸收光谱的测定 光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。 各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。 III 光合色素含量的测定 方法一：快速测定法 由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2 方法二: 分光光度计法 色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min, 记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。 测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1 ~ 0.8之间。 实验结果及分析 Ⅰ光合色素的提取与理化性质 一层：浅黄绿色 (1)皂化反应：溶液分为三层 二层：浅绿色 三层：深绿色 轻轻摇晃过程中：第一层由浅绿色逐渐变为黄绿色 第二三层逐渐变为一层，深绿色 在第一层下面出现一层油滴层 原因:叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开 荧光现象的观察 ? 用肉眼可以观察到叶绿素提取液在直射光照射下，反射光为蓝绿色，透射光为深红色 原因：叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光；反射光呈蓝绿色是因为叶绿素对蓝绿色光的吸收很少，而对于其他颜色光的吸收很多，所以会呈现出蓝绿色的反射光 II 光合色素的分离与吸收光谱 光合色素的分离如图所示 将涂有叶绿体色素的滤纸放入层析液后，叶