色谱柱使用及维护.pptVIP

前延峰 拖尾峰 裂缝或分叉峰 胖头峰或馒头峰 保留时间波动较大 常见的色谱峰异常问题及解决方案 前延峰 可能原因： a)填料丢失，多见于酸性物质 ，换柱 b)溶剂效应，采用流动相溶解样品 解决方法： 换柱 采用流动相溶解 增加缓冲盐的浓度，抑制次保留效应 提高柱温，加快传质速率 拖尾峰 可能原因： 样品过载 次保留效应，尤其是碱性物质 填料中残留的痕量金属离子 流动相试剂中的金属离子 不合适的缓冲盐溶液 解决方案： 降低进样量 加入扫尾剂（酸---1%乙酸；碱----10mmol/ml三乙胺，三乙胺无效，可改为EDTA） 尽量采用色谱级试剂 增加缓冲盐的浓度 产生次保留效应的因素--离子交换效应 离子交换效应：质子化的碱性分子与离子化的硅羟基发生离子交换产生次级保留效应 产生次保留效应的因素—痕量金属离子 金属离子所产生的强吸附位比硅羟基强50倍！！ 更易引起碱性物质的拖尾 严重拖尾-----强保留组分 严重拖尾峰的出现往往是强保留污染物在柱头进口处聚集的信号！！！ 峰分叉 可能原因： 柱填料坍塌 柱过载 色谱柱中存在“空穴”（使用中避免撞击） 解决方案： 更换色谱柱 降低进样量 宽峰或馒头峰 可能原因： 色谱柱方面：1、柱填料坍塌；2、色谱柱或保护柱被污染；3、过载 流动相方面：流速过低、缓冲盐浓度、流动相比例 柱外效应：样品池过大、色谱柱与检测器的链接管路较长、记录仪相应时间不对 保留时间波动较大的可能原因： 不同批号色谱柱（柱填料的硅羟基相互作用、比表面积、碳含量差异较大所致） 色谱柱失效 强烈建议：任何情况下，在规定的色谱柱上建立的方法，都应该用至少两个其他批次柱进行证实后，才可采用！！！ 不同厂家的同种色谱柱很少得到相同的分离！（迪马、菲罗门、安捷伦） 实验室中常见的不良习惯： 一个项目使用不同厂家型号的色谱柱进行有关物质检测 色谱柱的频换的更换各种流动相 流速直接从0ml/min变为1.0ml/min（安捷伦1260自带缓慢升流速装置） 猛烈撞击色谱柱 色谱柱两端的螺母未拧紧 使用缓冲盐不过渡 极性相差较大的流动相直接互换 保护柱不影响分离效果 填料选择不当会引起时间的漂移 安装不正确，死体积增大，峰形变差 色谱柱的使用误区 载碳量越高反相色谱柱就越好 保留能力取决于物质的疏水性大小 容易发生相塌陷 保留时间重现性较差 色谱柱的使用误区 新柱柱压越低，色谱柱越好 粒径均一，压降相对越低 压力与流动相的黏度、粒径大小有关 色谱柱的压力不应超过公式计算所得的30% 色谱柱的使用误区 HPLC色谱柱不能反向使用 不同厂家的柱子不一样----月旭的可以正反向使用，安捷伦只能正向使用，迫不得已才反向使用，菲罗门两端都可使用。 色谱柱的使用误区 常用的缓冲盐溶液有哪些？ 色谱柱参数ID=4.6um, ?=3,5um的意义？ 为什么色谱柱再生时都选用异丙醇？ 色谱小知识 色谱柱的使用与维护 实验室常用色谱柱：C8柱、C18柱、氰基柱、苯基柱、氨基柱、手性柱、离子交换柱 不同色谱柱的选择依据 色谱柱的结构 良好的色谱柱使用习惯及维护 建立方法时应注意的事项 色谱柱失效的特征指示 色谱柱类型 分离原理 备注 常规RP柱 相似相容 常规NP柱 相似相容 离子交换色谱柱 溶质离子与树脂交换中心离子相互作用强度的差异 流动相的pH、离子强度 手性色谱柱 引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异 一般以疏水作用和空间作用为主 一般色谱柱选择的依据： 以反相色谱为例： 当被两种以上的分析物的疏水性存在较大差异时，选择一般的C8/C18即可；当被分析物疏水性相差无几，但氢键作用相差较大时，可选用氰基柱、氨基柱；苯基柱对含有不同芳环的芳香化合物具有较好的分离能力；对离子性化合物，可采用离子交换柱或者离子对反相色谱柱 不锈钢柱管：可用于所有的有机溶剂与大多数水性缓冲液，然而含氯的流动相会缓慢地“卤素腐蚀”不锈钢柱管，尤其是低pH条件下 柱管不锈钢成分（铁、镍、铬）牢固络合的样品可能发生这类问题，但因为色谱柱内壁的表面积很小，发生不良反应的机会不大 色谱柱的结构 多孔烧结物（滤片）：封闭色谱柱的两端，固体色谱柱的填料 一般来说，5um与3um的微粒分别用2um与0.5um孔径的不锈钢滤片 发生不良反应的可能比色谱柱内壁大得多 峰型不好与样品回收率低可能预示滤片出现问题 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板 密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封 柱填料：色谱柱担体，常用的填料为硅胶、多孔聚合物、氧化铝等 优点 优良的物理特性 可控的成熟工艺 理想的表