设计生物化学实验动物组织DNA的提取.ppt

5. 加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀 DNA,观察现象。 6. 3000r/m离心10min，弃乙醇。 7. -20℃预冷的75%乙醇洗涤，3000r/m离心5min，弃乙醇，55℃干燥DNA. DNA纯化 将已提取的DNA粗品加入生理盐水中，再加入固体NaCl使沉淀最少，即DNA溶解度最大。 3000r/m离心5min，吸取上清液加入乙醇析出。 3000r/m离心5min，弃乙醇得到较纯净的DNA. 注意事项 选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成，取上清液时注意不要吸起中间的蛋白质。 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少或沉淀物太干燥，都将使溶解变得很困难。 酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取含高浓度的DNA，可加大抽提前 缓冲液的量或减 少所取组织的量。 琼脂糖凝胶电泳检测 实验目的 通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳 鉴定DNA的原理与方法 实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。 琼脂糖凝胶的分离范围较广，选择不同凝胶浓度和装置，从50个碱基对到几兆不同长度的DNA都可以实现分离。DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。例如DNA分子的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后，凝胶中的DNA可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到20pg的双链DNA。 实验材料 实验器材 水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55℃水浴；沸水浴；微量移液器 实验试剂 （1）DNA样品；DNA标准分子量标记物；琼脂糖；1x电泳缓冲液TBE；6x样品缓冲液 （2）溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。将配好的10 mg/ml溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至0.5μg/ml。 缓冲溶液配制表 缓冲溶液工作溶液 储存溶液（每升）TBE0.5x5x0.045mol/L Tris-硼酸54 g Tris 碱0.001mol/L EDTA27.5g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)6x样品缓冲液0.2% 溴酚蓝储存温度4℃50% (w/v) 蔗糖水液 实验操作 1. 照厂家说明准备好灌胶模具，置于水平面上（实验操作示意图如下）。2. 配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶，加入100ml TBE缓冲液，称取1克琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在55℃水浴中保温。在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度3~5mm，避免气泡产生。3. 室温放置30~45分钟，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水平板电泳槽。4. 在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面1mm，拔下梳齿形成样品池。5. 取样品与6X样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样品池中。6. 盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压1－5V/cm（按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端1cm时，切断电源。7. 从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于0.5ug/ml溴化乙啶水溶液中，室温下振摇染色30~45分钟。8. 回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。 注意事项 1. 溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。 2. 紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必须确保紫外线光源受到遮蔽。  思考影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些，分别有怎样的影响？ 真核生物组织中DNA的提取 Total DNA extraction from eukaryotic tissue 组员：肖淑娟 刘娟娟 张小琴 主讲人：杨丽苹 实验目的 掌握真核生物基因组DNA提取的一般原理 通过动物组织DNA的提取，掌握DNA 提取的方法和步骤 动物细胞基因组在提取过程中一般有以下几步: 1. 首先是机械法破细胞抽提； 2. 然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染； 3. 最后纯化出ＤＮＡ。 DNA提取原则 保