pET表达载体.docx

表达载体pET A.pET系统是有史以来在 E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。 目的基因被克隆到 pET质粒载体上，受噬菌体 T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含 T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定 (详见 I. F.部分)。如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和 pI 启动子控制的 T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的 T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入 IPTG 来启动表达。尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。两种 T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。 所有 pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。pET 表达系统包括质粒和宿主菌。您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。 B.使用许可及协议 Novagen的 T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有 T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。详情请垂询。 C. 系统组成 pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。 ? 选定的pET 载体DNA，10 micro;g ? 宿主菌BL21，BL21(DE3)以及BL21(DE3)pLysS甘油菌1, 2 ? 诱导对照克隆，甘油储存物 系统加感受态细胞包括所有上述组分以及一套 3种直接用于高效转化pET重组子的感受态宿主细胞。每种宿主菌感受态细胞足够用于10次转化： ? 0.2 ml分装NovaBlue，BL21(DE3)以及 BL21(DE3)pLysS感受态细胞 ? SOC培养基 ? 对照质粒 1、pET多肽表达系统包括BLR和BLR(DE3)pLysS宿主菌而非BL21系列宿主菌。 2、pET Trx 融合系统32 包括AD494系列以及BL21系列宿主菌。 单独提供的组分和相关产品：参见 Novagen目录或Novagen网站()pET 载体系 统和感受态细胞完全列表。 D.选择合适的 pET载体 pET载体最初由 Studier及其同事构建(Studier and Moffatt, 1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al., 1990)。 Novagen 开发的系列新 pET 载体则使目的蛋白的克隆、检测以及纯化更加容易。载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。 ? 转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和 AUG 起始密码子的目的基因。只有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和 pET-23(+)。 ?翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因。翻译载体的详细信息请参考 pET 载体特点一览表(第 7页)。 翻译载体在命名上与转录载体不同，多一个字母后缀，例如 pET-21a(+)，表示相对于 BamH I克隆位点识别序列GGATCC的阅读框。所有带后缀 a的载体从GGA三联密码子开始表达，带 b的从GAT 开始，带c的从BamH I识别序列ATC三联密码子开始。带 d后缀的载体阅读框和带 c的一样，不同的是它们有一个上游 Nco I克隆位点而非 Nde I位点以便直接将目的基因克隆到AUG起始密码子。 All of the information in this forum can see but cannt download, so despair , searching for help ! How to download the enclosures? 基本考虑因素 选择合适的pET 载体通常要综合考虑很多因素。其中包括下列一些基本因素： ?目的蛋白的应用 ?目的蛋白已知特定信息 ?克隆策略 pET 载体的应用多种多样。例