酵母细胞自噬与蛋白质结合.ppt

第三组汇报 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 * 一、实验基础 二、实验思路 四、实验结果 三、实验过程 实验基础 转染：将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。 基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。 实验基础 实验基础 免疫印迹法 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 实验基础 啤酒酵母细胞 自噬所必须的蛋白结合系统 修饰蛋白Apg12p的末端甘氨酸通过异肽腱被连接在Apg5p赖氨酸残基上，由Apg7p介导的 人类细胞 实验过程 hApg12，这是一个140个氨基酸的蛋白质，和酵母Apg12具有27%的一致性，具有48%的相似性 实验思路 hApg12与hApg5在人类细胞中共价结合 hApg12的c末端甘氨酸是结合做必须的 hApg5赖氨酸- 149是Apg12p结合的受体点 实验过程 Northern印迹法 hApg12转录物在所有组织的检查被发现,包括心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾癌、胰腺癌,，表明hApg12 mRNA广泛表达 泛素化是蛋白修饰系统 Apg7p and Apg10p，需要用于结合，Apg7p展示着泛素活化酶（E1）一类的同源性，Apg10p可能是一个泛素结合酶(E2)，因此至少四个蛋白质(Apg5p, -7p, -10p, and -12p)在蛋白结合体系中发挥作用，当它们任意一个基因有缺陷自噬都无法进行 虽然Apg12p结合系统类似于泛素化，Apg12p的氨基酸序列明显与泛素不同，考虑到其他发现的修饰蛋白是泛素化，Apg12p是第一个与泛素无关的蛋白修饰。 实验讨论 尽管Apg12系统与泛素化修饰系统相似，但是人类和酵母菌的Apg12比较大且没有泛素化的同源性。 Apg12看起来有一个单一的靶蛋白，Apg5 hApg12系统不是泛素化修饰 实验讨论 实验讨论 依旧无法证明酵母细胞中这个蛋白结合系统在自噬的哪一步行使功能，我们推测它的功能与自噬体的形成有关。 i.在apg5, apg7, apg10和 apg12突变株中没有发现自噬现象； ii.在酵母细胞中大多数的Apg12p, Apg5p, and Apg12p/Apg5p 在膜片段上存在； iii.在发生蛋白结合后， Apg12p的位置发生变化，在转染实验中，大约一半以上的hApg12 和 hApg5大量表达时，会在膜片段上检测到。 实验讨论 我们预测在人类的Apg12 结合系统与膜的活力有关。 现在正在检测它们精确的胞内位置以及在不同状况下的表达水平。 *