人教版选修1课件：5.3血红蛋白的提取和分离(共45张PPT).ppt

1 新情境·激趣引航血红蛋白是红细胞的主要成份。每个血红蛋白分子由4个血红素基团与珠蛋白构成，每个血红素又由4个吡咯环组成，在环中央有一个铁原子。血红蛋白中的铁在二价状态时，可与氧呈可逆性结合(氧合血红蛋白)，如果铁氧化为三价状态。血红蛋白则转变为高铁血红蛋白，就失去了载氧能力。 2 新课堂·互动探究学习目标 　 1.尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。 2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。 3.了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的原理。 新知预习一、分离蛋白质的原理与方法 1．分离蛋白质的原理 2．分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，也叫分配色谱法。 过程及原理 b．分离的过程 c.分离原理：依据相对分子质量的不同而将蛋白质分离。 (2)电泳法 电泳的概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 原理：利用了待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子本身的大小以及形状的不同，使带电分子在电场中产生不同的迁移速度，从而分离样品中的各种分子。 分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质-SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子的大小。 3．缓冲溶液 (1)组成：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例，可配制不同pH的缓冲液。 (2)作用：抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 激趣应用1 ——缓冲溶液的成分是怎样的？ 缓冲溶液中含对酸碱起缓冲作用的缓冲对，每一缓冲对均由弱酸和相应的强碱盐组成。细胞外液也有酸碱缓冲对，你能回忆并说出细胞外液中的酸碱缓冲对吗？ 提示：细胞外液中主要的酸碱缓冲对有：H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。 二、凝胶色谱法的实验操作 1．蛋白质的提取和分离步骤 (1)样品处理 (3)纯化：凝胶色谱法 (4)纯度鉴定：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 2．凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作 (2)凝胶色谱柱的装填 (3)样品的加入与洗脱 加样前：打开下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 加透析样品 调整缓冲液面：与凝胶面平齐。 ↓ 滴加透析样品：用吸管将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端。 ↓ 样品渗入凝胶床：加样后，打开下端出口，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ↓ 洗脱：打开下端出口，用20_mmol/L的磷酸缓冲液洗脱。 ↓ 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5_mL收集一管，连续收集。 3．操作提示 (1)红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。 (2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。 (3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 (4)蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。 激趣应用2 ——凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱有何区别？ (1)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都装填有不能通过“柱”下端多孔板(或多孔筛板)的颗粒，它们的颗粒功能有何不同？ (2)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都能进行化学反应吗？ 提示：(1)凝胶色谱柱装填的是凝胶颗粒，允许小分子进入，不允许大分子进入，通过延长小分子的路程使大分子与小分子分离。固定化酶的反应柱装填的是固定有酶的载体颗粒，既能催化反应物的反应，又保证了酶与反应物分子的分离，实现了酶的重复利用，节约了生产成本。 (2)不是。固定化酶的反应柱能进行化学反应，凝胶色谱柱不能进行化学反应。 3 新课堂·互动探究知识点一血红蛋白的提取和分离的原理1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析： 相对分子质量大 相对分子质量小 直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径 小于凝胶颗粒空隙直径 运动方式 垂直向下运动 无规则的扩散运动 运动速度 较快 较慢 运动路程 较短 较长 洗脱顺序 先从凝胶柱中洗脱出来 后从凝胶柱中洗脱出来 2.电泳方法： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同 在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小 特 别 提 醒(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 (2)测定蛋白质的相对分子质量常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，这