内蒙古大学生物技术 基因工程大实验开题报告创新.doc

学号 内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室 本科基因工程大实验开题报告 论文题目： 纳豆激酶基因表达载体的构建 及在大肠杆菌中的表达 学生姓名： 燕孟娇 年 级： 2008 专 业： 生物技术 指导教师： 苏慧敏 2011年 8 月7 日 学生姓名 张婷 民族 汉 性别 女 出生年月 1990年8月 论文题目 纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 开题时间 2011年8 月1日 结题时间 2011年 8月7 日 项目来源 本科生基因工程大实验课 一、立论依据 “纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”项目的选题和研究的意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处： 纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶(NarroKunase，NK)由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于 UK、SK、tPA的蛋白质，并可由肠道，吸收，纳豆激酶的体外、体内溶栓性质通过实验也已得到确定，同时得出纳豆激酶的体内溶栓活性为纤溶酶的四倍，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。 纳豆激酶的物理、生化特点： 1)纳豆激酶是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶（单链多肽酶），分子量为27728道尔顿。 2)纳豆激酶在温度超过50℃时迅速变性失活，但反复冻融对其影响不大。 3)纳豆激酶在PH值从7升至12时，10min内稳定；PH值低于5时，迅速变性失活。胃酸环境中的PH值只有1.2到2之间，纳豆激酶根本无法通过。4)纳豆激酶与粘性物质混合后，在PH值2-3的酸性环境中，还能保持不超过7.5%的活性。 5)纳豆激酶是大分子的单链多肽酶，可被肠道消化液（糜蛋白酶、胰蛋白酶、小肠液等）分解成氨基酸片段或分子量更小的肽链。 同其它生物活性物质一样，纳豆激酶的分秘表达受多种因素的影响。纳豆激酶基因在体外转录有两个启动位点，之间被15个核苷酸隔开；体内转录也在这两个位点或其附近。下游位点(P：)具有一个独特的d”识别序列。Moran等人对该基因的d”启动子和其它两种枯草芽孢杆菌的d”启动子做了比较，比较了它们的保守碱基序列，在一35区．P：启动子的共有序列为5个碱基；在一10区共有序列为8个碱基．两区之间被15个碱基隔开。另外两个碱基区可能调节该基因的表达．一个是在启动子上游35bp处的二分体对称区，另外就是mRNA 上核糖体结台位点，mRNA 上核糖体结台位点序列为：pppAA．A—A—G一0 0 A_0 00 U。 此外．在纳豆激酶基因的105-336bp处编码了一段有77个氨基酸的蛋白肽(pmpeptide)，其有可能参与调节纳豆激酶的活性。纳豆激酶的表达同其它枯草杆菌蛋白酶一样受葡萄糖阻遏和被许多SpoO 孢子形成突变株阻断，另外Cat A、hpr、Scoe突变株位点可以提高其表达。 参考文献 [1]谢秋玲,孙奋勇,廖美德,张玲,汪炬. 纳豆激酶原基因的克隆及表达[J]华南理工大学学报(自然科学版), 2002, (06) 朱立成,张耀洲. 纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备[J]浙江大学学报(理学版), 2006, (04) . Hong-Bo Hu,Shan-Jing Yao,Le-He Mei,Zi-Qiang Zhu,Byung-Ki Hur. Partial purification of nattokinase from Bacillus subtilis by expanded bed adsorption[J] Biotechnology Letters, 2000,22, (17) . [4] 付利，杨志兴.纳豆激酶的研究与应用[J],生物工程进展.1995,15(15):46-49. [5]陈丽娟,沙长青,任永春等.纳豆激酶溶解血栓机制[J],中国生物工程杂志,2003,23(4):53-56. [6] 丁贵平,蔡正森,王正刚.纳豆激酶的分离纯化及生化研究[J],氨基酸和生物资源,2001,23(3):13-16. [7] 闫达中，许芳，李洁.纳豆激酶基因克隆及其在大