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川农教学实践微生物结题报告课件
动物微生物学及免疫学
(实践教学)结题报告
疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪病料中病原菌分离鉴定
班 级:指导教师:
时 间:蒋
2015年6月
疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪病料中病原菌分离鉴定
指导老师:
摘要:肠杆菌科的细菌种类众多,在自然界广泛分布,本实验从疑似仔猪白痢与仔猪副伤害病死猪病料中培养分离病原菌,对该细菌进行分离培养、生化鉴定、药物敏感实验和动物实验,整个实验以微生物学的知识作为理论支撑,在实验过程中运用细菌分离鉴定的基本方法,达到实验目的。
关键字:仔猪白痢 仔猪副伤寒 大肠杆菌 沙门氏菌 分离鉴定
1 实验依据:
仔猪白痢也称迟发性大肠杆菌病,是一种肠道传染病,多发于10~30日龄。临诊上以下痢、排出灰白色粥状粪便为特征。
仔猪副伤寒也称猪沙门菌病,是由沙门菌引起的仔猪的一种传染病,常发生于6月龄以下仔猪,特别是2~4月龄仔猪,多见急性者为败血症,慢性者为坏死性肠炎。
大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)同属肠杆菌科,分别为埃希氏菌属和沙门氏菌属的代表菌。
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌,兼性厌氧,两端钝圆,散在或成对,大多数以周生鞭毛运动。碱性染料对本菌有良好的着色性,菌体两端偶尔略深染。在琼脂培养基形成圆形凸起、光滑、润湿、半透明、灰白色菌落;麦康凯琼脂上形成红色菌落;本菌能够发酵多重碳酸化合物产酸产气。大多数菌能够迅速发酵乳糖。
沙门氏菌为革兰氏阴性的直杆菌,兼性厌氧。通常都以周生鞭毛运动。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气。在三糖铁(TSI)上产生硫化氢。在肠道杆菌选择或鉴别培养基上,大多数菌因为不发酵乳糖而呈无色菌落。麦康凯琼脂上典型菌落呈透明、无色,有时带有暗色中心。
2 试验内容
平板和斜管培养基的制备;
病原菌增菌培养;
病原菌分离培养;
病原菌培养特性鉴定;
病原菌生化鉴定;
病原菌药物敏感实验。
3 试剂与器材
材料:麦康凯琼脂粉,琼脂粉,三糖铁琼脂,亚硫酸铋(BS)琼脂,伊红美蓝琼脂,氯化镁孔雀绿增菌液,牛肉膏,蛋白胨,氯化钠,磷酸氢二钾,结晶紫,石炭酸复红,95%乙醇,革兰氏碘液,生化管(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐还原、硫化氢),乙醚,药敏纸片(四环素、环丙沙星、卡那霉素、青霉素、呋喃唑酮);
器材:接种环,试管,培养皿,三角瓶,电炉,天平,移液枪,PH试纸,酒精灯,玻片,显微镜,恒温培养箱,高压灭菌锅,量尺。
4 方法和步骤
4.1 平板和斜管培养基的制备
根据需要制备普通琼脂培养基、普通肉汤、增菌培养基、麦康凯培养基、BS培养基、伊红美蓝培养基和三糖铁斜管培养基。
将配好的培养基装入三角瓶或试管进行高压蒸汽锅内,121℃灭菌30min。待三角瓶冷却至60℃在无菌室倒平板,每个平板约15ml。
4.2 病原菌的增菌与分离培养
无菌取病死猪心、肝病料,分别进行组织触片,自然晾干固定,美兰染色5min,冲洗后吸干镜检。
将心、肝病料剪成小块,分别接种于普通肉汤、增菌培养基各1支,在37 ℃水浴摇床中培养24 h。
4.3 病原菌培养特性鉴定
4.3.1 菌落特征观察
用接种环接种增菌培养基中的菌液于普通琼脂平板、BS平板、伊红美蓝平板和麦康凯平板,各2个,37 ℃培养24 h,观察病原菌在4种培养基上的菌落特征,并记录。发现有特征不同的多种菌落,分别取单个菌落进行镜检观察,取显微镜下符合大肠杆菌或沙门氏菌形态特征的菌落,继续纯化分离鉴定,直至得到较纯的菌。
4.3.2 病原菌形态染色特性鉴定
分别对4种培养基的单个疑似菌落进行镜检。
在洁净玻片上轻滴1滴蒸馏水,无菌勾取菌落于水中,火焰固定,结晶紫染色1-2min,洗涤,革兰氏碘液染色1-3min,洗涤,95%酒精脱色30-60s,洗涤,稀释的石炭酸复红染色10-30 s,洗涤,吸干多余水分,滴加香柏油,在10×100倍的显微镜镜检,观察并绘图。
4.4 TSI实验
取上述鉴定中符合大肠杆菌或沙门氏菌形态特征的菌落,以接种针挑取菌落涂布并穿刺接种于斜面,置36±1℃培养18-24h观察结果。
4.5 病原菌生化鉴定
分别取大肠杆菌和沙门氏菌的合格菌进行生化实验。
取生化管,在1/3-1/4处掰开,在酒精灯火焰旁,用接种针将菌落接种到11种(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐还原、枸缘酸盐、硫化氢)培养管生化管中,每种生化发酵管各1支,上下抽动3次接种针完成接种。每次接种前后都要对接种针进行灭菌,每次接种好一种培养管,将培养管倒插在泡沫板上。37℃培养48 h,观察并记录结果。
4.6 药敏试验
4.6.1 操作方法
将两种菌分别用灭菌接种环致密划
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