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主 要 内 容 大肠杆菌在分子生物学实验中的应用 生物工程用菌株优点： ★ 背景清楚：全基因组测序，共有4405个开放阅读框架。由于该菌株遗传背景清楚，并经过一系列突变筛选，使外源DNA在胞内不易发生重组或修饰，更适于作为基因操作的宿主菌。 ★ 生物安全：生物工程用菌株是在不断筛选后被挑选出的，这些菌株由于失去细胞壁的重要组分，在自然条件下无法生长，甚至普通的清洁剂都可以轻易杀灭。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也可避免对自然界造成危害。 ★ 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 ★ 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。 目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。 大肠杆菌在分子生物学实验中的应用 缺点： ★ 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区。 原核：CDNA； 真核：DNA ★ 转录信号不同：真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列 细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子 SD序列（Shine-Dalgarnosequence）： mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。 SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游 10个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序 列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助 从起始AUG处开始翻译。 大肠杆菌在分子生物学实验中的应用 缺点： ★ mRNA的分子结构差异：绝大多数真核mRNA分子的3?末端有poly(A)尾巴，在5?末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，阻止正常的转录和转译 ★ 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统：表达产生的蛋白质不能进行糖基化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而产生的蛋白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能）。 ★ 表达的蛋白质经常是不溶的，在细菌内形成包涵体，当表达的蛋白量超过菌体总蛋白10%时，容易形成包涵体。 ★ 细菌的蛋白酶：可以识别降解真核生物的蛋白质产物。 应用实例 大肠杆菌的培养与保存 ▲ 取2-5毫升液体LB培养基，到无菌培养管中； ▲ 用接种环从琼脂培养板上挑取单个菌落，接种到培养基中。注意要先蘸取少许液体在管壁将菌落研磨开，再轻摇试管使细菌均匀分散到培养基中； ▲ 盖上盖子，保证通气。37℃摇床 60rpm，培养过夜; ▲ 1:100转种到培养瓶中。通常250ml培养瓶中加培养液不超过100ml。37℃摇床（250rpm）培养，直至细菌生长到所需密度。 代表性细菌质粒（1） F因子，又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。 F质粒的整个基因组结构由三个主要区段组成：（1）转移区（2）复制区（3）重组区 重组区中有4个插入顺序（IS），通过和宿主染色体上的IS同源重组或通过转座，F因子可以整合到宿主不同位点上。由于宿主染色体上IS方向不同，所以整合的方向也随之不同。 代表性细菌质粒（1） 代表性细菌质粒（2）： R因子（resistance），抗药因子，带R因子的细菌有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌等G-菌，60-90%的G-菌耐药性由R因子转移。 R因子是细胞质性质粒，具有使寄主菌对链霉素、氯霉素、四环素等抗菌素或磺胺剂产生抗药性的基因群。和F因子一样，通过接合进行转移，获得该因子的细菌获得对多种药剂的抗性，给治疗带来很大麻烦。 R因子为环状双链DNA分子，由相连两个DNA片段组成，即抗性转移因子和抗性决定因子，R因子在细胞内的copy数可从1-2个到几十个，分为严紧型和松弛型，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000-3000个/细胞。 代表性细菌质粒（3）： Col因子，产大肠杆菌素因子，编码合成大肠杆菌素, 通过抑制复制、转录、转译或能量代谢而专一性地杀死不含Col因子的其他肠道细菌。 Col因子可分为两类： ColE1：无接合作用，松弛型多copy；广泛地用于重组DNA研究和体外复制系统。 ColIb：与F因子相