高效液相色谱结果分析-第二讲 (2).pptVIP

高效液相色谱 一.色谱数据处理 三.色谱图名词术语(1) 三.色谱图名词术语(2) 三.液相色谱图名词术语(3) 三.液相色谱图名词术语(4) 三.液相色谱图名词术语(5) 三.液相色谱图名词术语(6) 三.液相色谱图名词术语(7) 三.液相色谱图名词术语(8) 1.确定色谱条件: 色谱柱的选择，流动相、流速、检测波长、柱温及进样量Ｓ等。 2.绘制标准工作曲线 3.精密度试验与回收率试验 4.实际样品含量测定 * * 结果处理与分析 第二部分 (High performance Liquid Chromatography，HPLC) 一、色谱数据处理 二、色谱图 三、色谱图名词术语 四、色谱峰检测 五、HPLC测定步骤与内容 检测器 记录仪 积分仪 色谱工作站 色谱仪信号输出图 色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。 数据处理原理 自动处理 人工修正 峰的检测 数据采集 基线校正和重叠峰的分离 数据处理方法 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图, 其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间 二.色谱图 (Chromatogram) 样品组分分离示意图 色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号. 峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线. 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离. ←色谱峰 时间(分) 峰高 峰底 响应值 (mV) 基线 ↓ 切线峰宽(Peak Width, 峰宽):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离. 半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离 . 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值. 色谱峰的判断 (最小面积) 响应值 时间 峰面积 切线 半峰宽 切线峰宽 保留时间(TR)(Retention time): 组分从进样到出峰最大值所需的时间. 死时间(t0)(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）. 调整保留时间：tR’＝ tR－t0 保留体积(VR)(Retention volume): 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积. 死体积(V0)(Dead volume): 不被固定相滞留的组分, 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积. 调整保留体积：VR’＝VR－V0＝tR’ ? FC Fc: 流动相的流速 mL/min. 谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. 前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. 鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰. Excellent t = 1.0 - 1.05 Acceptable t = 1.2 Unacceptable t = 2 Awful t = 4 正常 前伸 基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号. 基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线波动. 基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变化. 基线 基线噪音 基线飘移 峰宽 半峰宽 标准偏差σ 标准偏差(σ)(Standard deviation): 0.607倍峰高处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。目的是为了计算柱效率(柱效)。 柱效（理论塔板数） ： 或 进样 图示中塔板数为3. 塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡 峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化： 依照信号斜率的变化检测信号 依照积分面积检测峰信号 四.色谱峰检测 切线 色谱峰的判断 最小面积 五.HPLC 测定步骤与内容 1.确定色谱条件 色谱柱的选择 流动相 流速 检测波长 柱温 进样量 2.绘制标准工作曲线 标准曲线是定量分析的根本依据. 药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好! 准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。