第三章、微生物细胞的破碎.ppt

第三章、微生物细胞的破碎 微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，称为胞外产物。(例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等) 还有许多是存在于细胞内(例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等)称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液， 对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 细胞壁的组成和结构 细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。 细菌的细胞壁 几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架——肽聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L－丙氮酸－D－谷氨酸－L－赖氨酸－D－丙氨酸。 肽聚糖键是N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸交替地通过β－（l→4）糖苷键联接而成。短肽接在N－乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形成了网状结构。 革兰氏阳性菌的细胞壁 革兰氏阳性菌的细胞壁较厚（15－50 nm），肽聚糖占40％一90％，其余是多糖和磷壁酸， 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.5－2.0nm），最外面还有一较厚的外壁层（8—10 nm），外壁层主要由脂蛋白，脂多糖组成。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 酵母菌的细胞壁 主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄增加而增加。 细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状 覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白， 再外面是由1，6－磷酸二酯键共价连接而成网状结构的甘露聚糖。有甘露聚糖－酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。 真菌的细胞壁 大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β－（1→3）键连接，某些以β－（l→6）键连接），几丁质（以微纤维状态存在）,糖蛋白。 真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 细胞壁的结构和细胞的破碎 破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。 在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。 球磨机 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 球磨机 高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂 高压匀浆法 适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。 超声波破碎仪 酶解法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。 优点：专一性强，发生酶解的条件温和。 缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。 溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂 自溶作用 是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。 影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。 自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。 渗透压冲击 是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。 冻结-融化法 将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。 对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。 另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。 干燥法 可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。 空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。 干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。 化学法 用酸碱及表面活性剂处理，可