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第三章 用于基因克隆的载体 3.5.2 噬菌粒(phagemid or phasmid) 噬菌粒载体的特点: 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像M13-DNA那样体外包装,并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多(10 kb) 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便,筛选容易 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA ?噬菌体感染细菌的早期:双链进行?型复制。 3.3.2 ?DNA的复制 模型 (1) ?型复制 (2)滚环复制 感染的晚期:启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 (1)构建原理: 3.3.3. ?噬菌体载体的构建 (2)构建过程 ①在这个非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型,作为选择标记 ③突变某些基因,使它成为安全载体 ④删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点 删除?噬菌体的非必需区,留出插入空间。 (3)人工构建的?噬菌体载体有两种类型: ① 插入型载体(insertion vectors): 如 ?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM607 1)免疫功能失活型: 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域(cI基因)内。 EcoR I cI ?gt10 插入导致载体不能合成阻遏物,??载体DNA不能进入溶源期,受体菌全部裂解,形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 选择标记: 如?NM1149载体的两个克隆位点(EcoR I 和Hind III)都是位于cI基因内部。 2)?-半乳糖苷酶失活型载体: 在?基因组中引入了LacZ’序列。(其上含有一个EcoR I 克隆位点)。 感染LacZ突变的大肠杆菌,经IPTG的诱导,利用Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ’ EcoR I Charon16A 选择标记: ② 替换型载体(substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后,可以将中间的区段切下来,与用同样酶切成的外源DNA片断置换。 可置换区 MCS MCS 如: ? EMBL4、Charon40等。 1)? EMBL4 ? EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片断,防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 2)Charon40 Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成,片断之间有Hae I 切点。 在克隆的时候,可以用Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断,以防止重新与载体连接。 左臂 可置换区 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 可取代片断中如果包含LacZ’,可用Xgal显色作筛选标记。 (4)?载体的筛选标记 ② 插入型载体 根据插入所引起的表型突变。 ① 置换型载体 ? DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。 3.3.4 ?载体的体外包装 在试管中与?噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒,才能高效地感染细菌,把重组DNA注入受体菌中。 (1)体外包装: 的D基因的产物也是头部蛋白,但主要与? DNA 进入头部和头部的成熟有关(只占20%)。 (2)体外包装过程 ① ?噬菌体外壳蛋白的合成 E 基因 的E 基因编码头部蛋白的主要成分(占头部总蛋白的70%)。 D基因 E基因突变 只合成尾部蛋白和包装识别蛋白 D基因突变 合成头部蛋白和尾部蛋白,但不能聚合和包装DNA 提取尾部蛋白 提取头部和尾部蛋白 重组的?载体DNA 体外包装成活性噬菌体 外源的重组?DNA载体被诱发与内源性原?DNA发生重组。 (3)体外包装存在的问题: ① 包装错误: 既能包装用于生产头部蛋白的内源性原?DNA,也能包装重组的?DNA载体。 ② 重组: ③ 体外包装的容量限制: 必须在正常野生型容量的75%—105% (36—51kb)之间。 既不能超过正常野生型容量的5%; 又不能低于正常野生型容量的75% 野生型?DNA的必须区是28kb,所以?载体的最大克隆容量是23kb。(实际上为15kb)。 3.3.5 l-DNA作为载体的优点: l-DNA在体外包装成噬菌体颗粒,能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb,远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段,但不适合表
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