第九章外源基因在宿主细胞中的.ppt

Chapter9: High-level expression of foreign genes §1.gene silence §2. expression systems of foreign gene §3.Isolating and purifying the product of foreign genes §1.gene silence(基因沉默) Gene Silencing ??外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。. Gene silencing can occur at either transcriptional level(TGS,Transcriptional Gene Silencing), or post-transcriptional level(PTGS, Post-Transcriptional Gene Silencing). TGS: Methylation Induced Repeat-Induced Gene Silencing(RIGC), position effect ,and so on PTGS: cosuppression, and so on Methylation Induced 一、外源基因在原核细胞中的表达 欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件： ① 通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并利用宿主菌的酶系统合成外源蛋白； ② 外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA； ③ 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达； ④ 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame，ORF)； ⑤ 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。 （一） 基因表达的调控序列 对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。 -35 Box 和 -10 Box 原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。 最佳启动子必须具备的条件 ① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。 ② 应呈现低水平的基础转录 便于表达毒性蛋白等。 ③应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。 （2）-35区与-10区之间的距离 间隔为17bp时，启动子最强。 （3） -35区和-10区的碱基顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。 2．S-D序列 mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。 S-D序列(AGGAGG)后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。 SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。 AUG左侧的三个碱基也有影响。 ?-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 3．终止子 在一个基因的3’端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。 共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构 。 在构建表达载体时，为防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。 4、密码子的选择性 起始密码子：GUG 为 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 主密码子：使用的频率高 罕用密码子：基因组中使用的频率较低。 如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之则低。 构建表达载体时，要对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整以适应宿主细胞。