第四章动植物细胞培养产酶.ppt

动物细胞培养的特点 主要用于生产蛋白质 生长缓慢 容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素 对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构） 大部分具有贴壁依赖性 —— 贴壁培养 培养基成分复杂，价格高昂 细胞生命有限，一般最多继代培养50代即退化死亡 动物细胞培养方式 —— 悬浮培养 适用于非贴壁依赖型细胞 杂交瘤细胞、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞 类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别 对通气、搅拌耐受性差 对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例 CO2 优点（相对于贴壁培养） 细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好 传代培养容易，无需消化分散细胞 培养基中营养成分利用率高 动物细胞培养方式 —— 贴壁培养 适用于贴壁依赖型细胞 上皮细胞、成纤维细胞 细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂 滚瓶培养系统 结构简单，但比表面积小 微载体培养系统 由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球 兼具单层培养和悬浮培养的优势 细胞生长环境均一 动物细胞培养方式 —— 固定化培养 贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用 吸附法 载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 贴壁型细胞的微载体培养即属此类 包埋法 将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中 细胞不易脱落 固定化培养优点 细胞损伤程度低，可重复使用 产物分离容易 动物细胞培养过程 种质细胞 体细胞（动物体内组织取出） 杂交瘤细胞 基本工艺过程 动物细胞培养基 氨基酸：各种必需氨基酸，Gln 等，作为碳源和能源利用 维生素：B族和维C，可由血清提供 无机盐：调节渗透压 微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供 葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸） 激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松等，可由血清提供 生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，一般来源于血清 培养基配制 配制母液，使用前过滤除菌、稀释；Gln 单独配制，冷冻保存 动物细胞培养的工艺条件及其控制 温度 哺乳动物细胞培养一般控制在 36.5±0.25 oC 温度也影响 CO2 溶解度，从而影响培养液 pH 值 渗透压 保持细胞内外等渗状态，一般700～850 kPa 溶解氧 供氧不足：细胞生长受抑制 过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞 用混合气代替空气（空气、O2、N2、CO2） 动物细胞培养的工艺条件及其控制 pH 值与 CO2 浓度 动物细胞培养液 pH 在 7.0～7.6 之间，以 pH 7.4 为最佳 最常用的缓冲体系为 CO2 / HCO3- 动物细胞培养时缺少 CO2，培养液中的 HCO3- 会被耗尽；CO2 保持了 HCO3- 的浓度，以提供稳定的缓冲环境 通常 CO2 浓度维持在 2～10% 之间 指示剂：酚红 动物细胞培养的工艺条件及其控制 pH 值 —— HEPES 缓冲体系 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acid HEPES is a zwitterionic organic chemical buffering agent. HEPES is widely used in cell culture, largely because it is better at maintaining physiological pH despite changes in carbon dioxide concentration (produced by cellular respiration) when compared to bicarbonate buffers, which are also commonly used in cell culture. HEPES is like water in that its dissociation decreases as the temperature decreases. This makes HEPES a more effective buffering agent for maintaining enzyme structure and function at low temperatures. 相关问题 —— 为什么培养的细胞要及时传代 传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继续扩大培养的阶段 体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长 当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长 如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞，导致正常细胞的退化 ? 产酶实例 ——