第四章植物脱毒技术.ppt

由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此，若是使用未受侵染或侵染程度较轻的个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常常表现遗传变异性，在园艺和造林业中，品种的无性繁殖十分重要，而这一般都是通过营养繁殖实现的。如果在一个品种中，并非全部母株都受到了侵染，那么只要选出一个或几个无病株进行营养繁殖，也有可能建立起无病的核心原种。但是，若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病植株的惟一办法，就是由该植株的营养体部分把病原菌消除，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，然后就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。 众所周知，病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。在较老的组织中，病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。分生组织所以能逃避病毒的侵染，可能的原因是：①在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖；②在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制；③倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，因而分生组织不受侵染；④在 茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。 茎尖培养不但可以去病毒，而且可以去掉所有的病原菌(包括细菌、真菌等） 热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求为止。若钝化病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的效果。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。而且要对植物进行修剪，以增加植物忍受热处理的能力。 应用热疗法消除病毒的一个主要限制在于，并非所有的病毒都对热处理敏感，例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒（leaf rool virus）。 和单独采用热疗法相比，茎尖培养具有更广泛的适用性。很多不能由单独的热处理消除的病毒，可以通过茎尖培养和热处理相结合，或单独的茎尖培养而消除。因而，茎尖培养现在已经成为消除病毒的一个很常用的手段。 茎尖（shoot tip),约0.1－1mm，多数是由茎尖培养得到去病毒植株。 或者是茎的顶端分生组织（apical meristem)0.25mm以内。 三、方法 解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。 茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒（10分钟）。 在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。当形似一个透明闪亮的半球形顶端分生组织暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后用同一工具接种到培养基上。对于难以生根的要嫁接到健康的砧木上。 注意，不要太大，以免带有较老的组织。 四、茎尖培养中影响脱毒效果的因素 （一）培养基 MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。下表是几种常用于茎尖培养的培养基。 虽然较大的茎尖外植体（500μm）或更长在不含生长调节剂的培养基中也能产生一些完整的植株，但一般来说，含有少量（0.1－0.5mg/L的生长素或细胞分裂素或二者皆有常常是有利的。 在各种不同的生长素中，应当避免使用2，4－D因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。 （二）外植体大小 在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，在木薯中，只有200 μm长的外植体能够形成完整的植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小外植体可能也不利于茎的生根。然而，不应当离开脱毒效率（它与外植体的大小呈负相关）单独看待外植体的存活率，因此，外植体应小到足以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。 除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。大黄离体顶端分生组织必须带有2～3个叶原基。Mrashige（1970）等虽然证实了不带叶原基的离体顶端分生组织有可能进行无限生长，并发育成完整的植株，但他们认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节剂的培养基中，离体顶端分生组织可能在组织重建过程中迅速形成双极性轴。虽然培养不带叶原基的顶端分生组织是可能的，但对于脱毒来说，看来并不实际可行。正如Murashige所说的，“如果培养方法得当，用较大的茎尖做外植体，其消毒的效果并不一定比只用分生组织差。” （三）、 培养条件 在茎尖培养中照光培养通常都比暗培养的效果好