组织培养技术-2012.pptVIP

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组织培养 Tissue Culture 一、组织培养的定义 组织培养: 细胞、组织或器官→离体→合适的培养液、温度、无菌→使之生存和生长 根据培养物的不同,组织培养又可分: 细胞培养、组织培养和器官培养。 二、组织培养的应用 1. 优点: (1)研究对象是活细胞,可长时间动态观察细胞的形态结构和生命活动。 (2)研究对象广泛,包括各种组织细胞。 (3)可研究各种理化因素(温度、药物、毒素等)对细胞代谢、增殖、分化的影响。 (4)研究方法多样,如倒置、荧光、电子显微镜、组织化学、同位素标记等,研究结果便于观察记录。 应用: 病毒学:细胞培养是分离培养病毒的重要手段,用于病毒感染的诊断,生产病毒疫苗。 免疫学:杂交瘤-单克隆抗体技术。 遗传学:从子宫取得胎儿细胞做染色体分析,进行遗传学诊断,试管婴儿等。 肿瘤学:抗肿瘤药物筛选。 二、组织培养的应用 2. 不足之处: 体外与体内培养条件不完全相同,失去神经内分泌系统的调节作用,培养的细胞存在一定的差异,故对结果的判断应慎重。 三、培养细胞的特性 1. 培养细胞的分型(按生长方式分) (1)贴附型: (2)悬浮型: 1. 培养细胞的分型(按生长方式分) (1)贴附型:大部分细胞附着于支持物表面生长,分化不明显,形态单一,常反映其胚层起源。如上皮细胞型,成纤维细胞型,多形细胞型。 (2)悬浮型:不贴附于支持物上,而呈悬浮状态生长,细胞呈圆形,单个或细胞团排列;见于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞。 三、培养细胞的特性 2. 培养细胞的生长和增殖 原代培养(Primary Culture):从体内取出组织开始在体外培养,在其传代之前。 传代培养(Subculture): 将细胞分离成两部分获更多至新的培养器皿中,并补充更新培养液。 细胞系(Cell line):原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。 细胞系的生长过程 细胞系的生长过程 原代培养期:1-4周,与体内细胞相似,但分裂不旺盛,含细胞类型较多。 传代期:持续时间最长,细胞分裂增殖旺盛,保留原组织细胞的很多特征,一般传代30-50次后,细胞增殖逐渐缓慢。 衰退期:细胞增殖缓慢,并逐渐停止,细胞形态轮廓增强,最后衰退、死亡。 实验研究的最佳时期: 三、培养细胞的特性 1. 营养需要: 碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素 防止污染 要注意防止微生物(细菌、病毒、真菌、支原体等)的污染、不同细胞类型的交叉污染。 出现以下情况时培养细胞可能有污染: 1) 培养液的酸碱度异常改变,如短期内颜色变黄 ; 2) 培养液出现混浊; 3) 光镜观察到大量颗粒或菌丝; 4) 细胞生长停止或出现死亡。 四、组织培养的常用设备 1. 仪器 包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保存的设备,如无菌室、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒置显微镜、离心机、液氮容器等。 超净工作台 CO2培养箱 四、组织培养的常用设备 2. 器皿 四、组织培养的常用设备 3. 试剂 (1)天然培养基:动物血清(如胎牛血清、小牛血清)。 (2)合成培养基:如RPMI1640、DMEM、199等。 多采用合成培养基+天然培养基(5-20%)。 (3)平衡盐溶液:由无机盐和葡萄糖组成,用于洗涤、配 液、维持渗透压,调节PH值等,如PBS、Hank’s等。 (4)消化液:用于消化解离组织块,使贴壁细胞从附着物 脱离。如胰酶、EDTA、胶原酶等。 五、基本培养技术 1. 无菌操作 2. 取材 3. 组织分离 4. 原代培养 5. 传代培养 6. 细胞冻存与复苏 五、基本培养技术 1. 无菌操作: 防止污染是决定组织培养成败的关键,必须无菌操作! (1)培养前的消毒灭菌 待用物品:洗涤、消毒灭菌。 无菌室:紫外线照射30-50min,新洁尔灭拖地。 超净台:75%酒精擦洗,紫外线灭菌等照射30min。 (2)洗手和着装 彻底洗手,着清洁工作服,酒精消毒手。 (3)无菌培养操作 超净台内操作,点燃酒精灯,火焰附近操作,在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。 不直接用手触及器皿的无菌部分,如瓶口、瓶塞内侧,必要时借助镊子。 吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能混用。 转移液体时,吸管口不能触及瓶口,以防交叉污染。 饭盒、瓶子不要过早打开,使用后及时盖好,瓶塞倒置在桌面。 面向操作台时勿大声讲话、咳嗽,以免喷出唾沫,污染工作台面。 操作完毕,整理台面,酒精擦拭。 五 、基本培养技术 2. 取材

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