细胞器的分离、纯化实验.pptVIP

细胞器的分离、纯化 — 细胞分级分离法;实验目的;应用范围： 1.病毒及亚细胞 组份分离 2.蛋白梯度分离 3.脂蛋白分离 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯 ;认识离心机及学习离心机的使用方法 学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法;实验原理;相对离心力（RCF） 由于转头有不同的制造商制造，半径不同，故用相对离心力来表示离心力的大小。 RCF (×g) = Fc/F重力 = mG/mg = r·ω2/g = 1.119×10-5·N2·r =11.2r(N/1000)2 也有： 根据这个公式，相对离心力（RCF）和每分钟转数（N）之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。;实验用品;台式高、超速离心机 0.6-10万rpm;离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。 ;一般制备离心;?高速冰冻离心机; 从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。 差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。 其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。 ;Low speed;密度梯度离心法： 用具有梯度的介质来替换离心管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分别收集。 该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不宜掌握。? ; 将离心机转数换算为相对离心力时， 首先，在 r标尺上取已知的半径和在 N 标尺上取已知的离心机转数。 然后，将这两点间划一条直线，在图中间 RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。 注意，若已知的转数值处于 N 标尺的右边，则应读取 RCF 标尺右边的数值；同样，转数值处于 N 标尺左边，则读取 RCF标尺左边的数值。;应急处理： 如果离心时发现离心管破裂，必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾桶，再用75%酒精进行擦拭消毒，如必要需用移动紫外灯照射30～60分钟后才能开始实验。 注意事项： a）离心机应始终处于水平位置，与外接电源电压匹配，并要求有良好的接地线。 b）开机前应检查机腔有无异物掉入。注意事项： c）样品应预先平衡，使用离心机微量离心时离心套管与样品应同时平衡。 d）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免侵蚀机腔或造成事故。 e）每次操作完毕，应做好使用情况记录，应定期对机器各项性能进行检修。 f）离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。 ;玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在0-4℃） 1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g，在冰箱中放置1小时 2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(重量体积比g:ml)比例加入离心匀浆介质，快速研??，注意先加入少许介质液，研碎后将余液加入 3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心10min弃沉淀 5.取上清液在低温高速离心机上9950rpm离心10min弃上清液 6.所留沉淀用匀浆介质液洗涤，以9950rpm离心10min弃上清 7.将所得沉淀悬浮于0.5M，ph=7.2甘露醇中，至于冰箱备用。 8.将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上用1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖液（ph=7.4）染色20min 9.加干净的盖玻片。镜检最好用相差显微镜，所有的线粒体都被染成蓝绿色颗粒，检验制备的线粒体的纯度;菠菜叶叶绿体的分离（整个过程保持0℃ ） 1取去叶脉的的新鲜菠菜叶5g于研钵中，加入0.35mol/L NaCl溶液15ml研磨。注意开始研磨时也是先加入少许介质，研磨后加入余液 2绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干净的离心管中，以1000rpm离心4min，除去沉淀。 3上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心5min，所得的沉淀是叶绿体 4用0.35mol/L NaCl 溶液稀释，放置于冰箱中保存。在干净的载玻片上滴加