细胞悬浮培养课件.ppt

2.1.2 特点 培养基体积固定 当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长也停止 必须适当搅拌 2.1.3 继代的方法和最佳时期 继代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。 注意：要适当稀释 2.1.4 细胞生长曲线 在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。 细胞的生长呈S形曲线 由悬浮细胞再生植株的途径 由悬浮细胞直接形成体细胞胚 先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株 3 细胞悬浮培养的培养基 3.1 悬浮培养对培养基的要求 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基，一般也适用于建立该物种的悬浮培养。 在活跃生长的悬浮培养物中，无机磷酸盐的消耗很快，不久成为限制因子。 Noguchi等(1977)证明，把烟草悬浮培养物保存在一种含有标准的MS无机盐培养基中，培养开始3d之内无机磷酸盐的浓度就几乎下降为零，即使把培养基中磷酸盐的浓度提高到原来的水平的3倍，5d之内也会被细胞全部用完。 高等植物的悬浮培养，B5和ER培养基。 3.2 条件培养基 把在液体培养基里 培养4～6周的高浓度细胞滤掉，而用他的培养基制成悬滴或薄层来培养单细胞或低密度细胞群体。 3.3 培养基的振荡 防治细胞缺氧死亡 防治大的细胞团的形成 3.4 悬浮培养细胞的同步化 同步培养： 指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。 应用：为了便于研究细胞分裂和细胞代谢 3.4.1 物理方法 A 按细胞团的大小 通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）的控制，以实现高度的同步化 B 低温休克法 通过对生长环境条件（光照、温度等）的控制，以实现 高度的同步化 3.4.2 化学方法 A 饥饿法 先对细胞断绝一种细胞分裂所必须的营养物质成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。 细胞周期（cell cycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。 间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。 细胞分裂期：前期，中期，后期，末期 3.4.2 化学方法 B 抑制法 使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶、羟基尿和胸腺嘧啶脱氧核苷 当细胞受到化学药物抑制时，细胞周期只能进行到G1，细胞滞留在G1期S期的边界上。 2.2 连续培养（Continuous culture） 加入培养基 排出培养基及其培养物 二者体积相等 分：开放式连续培养 封闭式连续培养 开放式和封闭式区别 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加； 开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出 。 连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究 某种生长限制因子对细胞生长的影响 次生物质的大量生产 紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg * 植物细胞 悬浮培养技术 单细胞的分离 由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织（如愈伤组织） 中分离单细胞 1 由完整的植物器官分离单细胞 机械法 酶解法 叶片是分离单细胞的最好材料 1.1 机械法 方法A：用刀片刮叶片 (花生成熟叶片) 具体方法: 撕去表皮 露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞 方法B：叶片研碎、离心 轻轻研磨 加研磨介质 过滤、离心 研磨介质：40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol tris—HCL (三羟甲基氨基甲烷 ) PH 7.8 注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。 注意：大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分离。 （叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形成一种互锁结构） 事例 分离篱天剑叶肉细胞的机械方法 叶片消毒 匀浆 过滤 离心 植板 75％酒精， 7％次氯酸钠 10ml培养基 1.5克1cm2叶片 低速，去碎屑，游离细胞沉降 1.2 酶