细胞表面分子的检测与分析.ppt

本次实验课流程 课件讲述 40min 实验演示 20min 流式细胞仪硬件及软件介绍 30min 上机检测 40min 解惑答疑 15min 流式在细胞表面分子检测中的应用 免疫细胞及其亚群的检测与功能分析 例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等 血液系统细胞表面标志的研究 例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、 血小板分析辅助诊断相关疾病等 细胞群体及细胞表面标志变化的监测 例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化 细胞表面标志构成性质的分析 例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析 标本来源 外周血 全血溶血、PBMC 骨髓穿刺液 体液、灌洗液 实体组织 新鲜组织、石蜡包埋样本 培养的细胞 原代细胞 细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞 标本制备 标本制备 二、全血标本的制备 “ABC”溶血（Beckman） 取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次 加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul, 轻轻振荡15s； C液100ul, 振荡10s，免洗上机检测。 “ACK”溶血（自配） 以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混 匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反 复2～3次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标 记。 标本制备 三、外周血单个核细胞的制备 （1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀； （2）沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll，勿用力过大； （3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层 为分离液层，底层为红细胞层； （4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水 洗两遍，PBS重悬； （5）荧光标记。 标本制备 标记方法 直接免疫荧光法 特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。 间接免疫荧光法 特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特异性染色，结果不易判断。（建议只用于单标检测） 直接、间接混合染色法 染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直 接标记。 对照设置 阴性对照 调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。常用的有：同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照 阳性对照 检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。 空白对照 确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。 补偿对照 多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。 同型对照（Isotype Control） 双色标记荧光补偿 荧光补偿对照 注意事项 样本的采集、储存 样本的染色 全血样本的溶血效果 流式实验对照的设置 样本的采集 手术切除的新鲜标本取材时，要避免出血或组织坏 死。深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，造成检测结果的误差。 采集静脉血样本时，要避免发生溶血。 收集培养的细胞时，要注意选择消化的方法和试剂。 样本的储存 原则：时间越短越好 肝素抗凝的外周血和骨髓：室温 ≦72小时 EDTA抗凝的标本：室温 ≦ 24小时 ACD抗凝的外周血：室温 ≦ 72小时 ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝 粒细胞、血小板功能检测：即刻检测 单核细胞表面抗原分析： ≦1小时，4℃ 嗜酸性粒细胞表面抗原分析： ≦24小时，4℃ 淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析： ≦72小时 样本的染色 影响抗原抗体反应的因素 电解质、反应温度与时间 、PH值（7.2～7.4） 流式抗体的选择 根据流式细胞仪的类型选择抗体 抗体应用级别、滴度和使用量的选择 根据抗原表达量选择抗体 全血样本：溶血效果很重要 结语 流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准 最佳样本制备方法需要根据具体情况独立设定评估 常用的荧光染料 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620