肿瘤细胞培养技术-林星石.ppt

肿 瘤 细 胞 培 养 技 术解放军总医院免疫室林星石研究员 Histroy 肿瘤类型：间充质 上皮 神经外胚层 造血源性（1955-1958-1963-1965） In vitro: 原代 传代 建系（1967-1970） 配基成分：纯血清 含血清 无血清 生物学特性：细胞 亚细胞 酶和分子 肿瘤细胞in vitro的特点 细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 ? 逐渐一致 增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50% 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化 变低分化 表面性状：负电荷数量正常，贴壁性?，抗原性可 变异 接触抑制减弱或消失： 悬浮生长特征： 成瘤性：移植到动物体内可成瘤 肿瘤细胞in vitro 培基 RPMI1640：最常用，+10~20%FCS，上皮性 或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺） DMEM：常用 F12： 适用于上皮性癌，如肝癌， L-15： 注意：+2g/L NaHco3 或 +20mmol/L HEPES?pH7.2 RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤 培养液特殊添加剂 常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂 终浓度 添加剂 终浓度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 ?g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氢化可的松 10-5mol/ml 肿瘤细胞的培养 与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养 细胞分裂增殖的调控（细胞周期） 多种基因的协同作用 调控因子： 基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性 肿瘤细胞 细胞间的相互影响 不同亚群代表不同分化程度的细胞群 表型、形态、受体、对因子的反应等 均不同 不同亚群释放不同的正负调节因子 (阴阳调控) 细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控 一个重要而复杂的因素 因素 高分化 低分化 —————————————————— 胰岛素 生长 - 凝血孝素 生长 - 前列腺素 促进（400) 抑制 激情素 - 助黏附 维生素A 抑制生长及分化 ____________________________________ 调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化 影响培养肿瘤细胞生长的因素 PH 营养：如血清效价低 细胞生长因子的自分泌及旁分泌 癌基因抑癌基因的变化 排泄废物的影响 细胞外基质的作用 细胞相互间的作用 污染 培养技术 - 取材 手术标本 活检标本 胸腹水穿刺 细针头穿刺 内窥镜活检 关键：新鲜、无菌、及时、准确 技术- 分离纯化 分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分离 纯化：反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型 流式细胞仪分选 克隆建株 高转移株的建立：反复接种 技术-培养 原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，