抗体分子改造教案.ppt

第七节 抗体分子的改造和基因工程 自1975年Catton 和Milstein等研究制造出单克隆抗体（MAb）技术以来，获得了迅速的发展和极为广泛的应用。但也确实存在不少难以克服的问题，如绝大多数的Mab是鼠源性的，对人有较强的免疫原性。如果用于人的治疗，不出2周就会产生人对鼠血清的免疫应答，患者体内存在的人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA），不仅降低了疗效，严重的可引起患者出现血清病。 随着分子遗传学、生物化学、特别是分子生物学的发展，人们开始着手利用DNA分子重组技术，改造和生产所需要的特异性单链抗体、免疫粘连素、超变区多肽，直到用丝状噬菌体表面呈现技术构建和筛选抗体基因文库。 一、双特异性抗体 免疫球蛋白分子具有重链、轻链组成的4条肽链结构，它们共同组成2个抗原结合点。由于2个结合点的抗原特异性相同，故表现为单一特异性。 双特异性抗体是将2个结合点表现为不同的特异性，抗体的一个结合点的特异性表现为靶细胞（如肿瘤细胞）结合，另一结合点可与药物（如蓖麻毒素、抗癌药物、细胞毒性细胞）结合。 这种双特异性的结合，可使作用物直接地、高密度地作用于靶细胞，提高了疗效，从而可相对地减少对患者的副作用。 制备双特异性抗体的方法主要有3种方法： （1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。 它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式： 重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子： LH-HL，KG-GK 重链特异性相同的配对抗体分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重链、轻链特异性不同的配对抗体分子： LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK 在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗体分子。 （2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。 通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。 用于制备双功能抗体的Mab可以是完整分子，也可是经胃酶水解获得F（abˊ）2片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效果较好。 （3）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。 这种方法制备的双功能抗体可选择合适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较好的产量较高的双功能抗体。由于只有较少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失 二、嵌合抗体 在肿瘤治疗中，带有抗瘤药物或同位素等的抗体具有导向作用，从而可定位诊断或定向杀伤肿瘤细胞。 为解决鼠源免疫Mab免疫原性这一难题，人们又设计了小鼠-人工嵌合抗体（chimerie antibody）的新型抗体。 其原理是取某一Mab基因的V区，与人Ig基因的C区连接，然后插入到表达质粒中，传染骨髓瘤细胞即产生出鼠-人嵌合抗体。 由于Ig的C区是人源的，这种抗体对人的免疫性就大为降低，采用不亚类的人C区基因，便可改变抗体的效应功能，以获抗肿瘤的最佳效果。 鼠-人嵌合抗体并不能彻底清除鼠源免疫原性，于是进一步提出重构抗体的设想。 即：人化抗体 三、人化抗体 抗体的抗原结合区域（V）与空间结构主要由抗体V区中3个CDRS（互补决定区）所决定，所以这一抗体的构建是用原鼠IgV区中的CDR区插入到人IgV的框架区。 这样构建成的重组分子既保留了结合抗原的功能，又消除了鼠源的免疫原性。这类人化抗体（humanhized antibodies）也可称为重构抗体。 为了构建这类抗体，首先需要测出MabV区的核苷酸序列，根据其中的CDRS序列，用全合成或点突变的方法将人Ig重构成MabV区的CDRS序列，然后将这种重构的V区基因与人IgC区基因连接，构成完整的人Ig基因，再于骨髓瘤细胞内表达。 四、单链抗体 用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核苷酸，将重链V区（3ˊ）与轻链V区（5ˊ）端连接在一起（VH-linker-VL）即成单链抗体基因，将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体（single chain antibodies）。