实验三、 大肠杆菌半乳糖苷酶诱导表达教学.ppt

马玉超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话 Email:myc0307@ 现代微生物学实验技术 实 验 内 容 ? 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ? 转座子随机突变及目的表型的筛选 ? 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ? 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ? 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 张妙直 实验目的 1. 加深对大肠杆菌乳糖操纵子的理解； 2. 证实β-半乳糖苷酶是诱导表达的，且该酶的合成受到严格调控。 乳糖操纵子 调节基因 结构基因 i p o z y a 控制单元 操纵基因 结构基因 调节基因 启动子 阻遏物 ?-半乳糖苷酶 透性酶 乙酰基转移酶 负调控模型 诱导物：乳糖或IPTG 实验原理 操纵基因 结构基因 调节基因 启动子 ?-半乳糖苷酶 透性酶 乙酰基转移酶 操纵子 正调控模型 cAMP-CAP复合物 CAP结合位点 调节基因 结构基因 i p o z y a 控制单元 实验原理 大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一类诱导酶 ? 无作用底物(乳糖或半乳糖苷)时，几个分子/细胞； ? 中性培养基中加入乳糖(诱导物)， 103~105倍； ? IPTG，不被分解，比乳糖提高~3倍； ? 葡萄糖效应：葡萄糖和IPTG，被显著阻遏； ? 葡萄糖+IPTG+cAMP，不受葡萄糖影响。 实验原理 邻硝基苯酚-β-D-吡喃型 半乳糖苷 ONPG Β-半乳糖苷酶 邻硝基苯酚 ONP +乳糖 420nm下吸光度 实验原理 实验材料 菌株 大肠杆菌 (E. coli K12) 2. 培养基及试剂 (1). 基本培养基(M9培养基) KH2PO4 30g； Na2HPO4 60g；NaCl 5g；NH4Cl 10g。 溶解后加水至1L，121℃灭菌20min。 灭菌后，在100 ml M9中加入： 0.1 mol/L MgSO4 10ml, 0.01 mol/L CaCl2 10 ml, 加无菌水至1L，作为基本培养基。 (2). 2×YT培养基 蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g，加去离子水至1L。 (3). Z缓冲液 每升含有一下成分： Na2HPO4·12H2O (0.06 mol/L) 21.5g NaH2PO4·2H2O (0.04 mol/L) 6.2g KCl (0.04 mol/L) (0.01 mol/L) 0.75g MgSO4·7H2O (0.001 mol/L) 0.246g 巯基乙醇 (0.05 mol/L) 2.7 ml pH 7.0 (4). 其他试剂 10% 甘油，10%乳糖，10%葡萄糖，IPTG (200mg/ml), ONPG (4mg/ml), 1 mol/L Na2CO3 0.1% SDS, 氯仿 3. 主要仪器 可见光分光光度计，摇床 实验步骤 大肠杆菌中β-半乳糖苷酶的诱导合成 菌悬液制备 将E.coli K12接种到固体2×YT平板上进行活化，挑取单菌落接种至5 ml 2×YT 液体培养基中，37℃培养过夜，2%的接种量接种至 25 ml甘油培养基中， 37℃培养 18 h，作为下面实验接种用的种子液。 分5组实验，准备5份种子液。 注：平板不要大家准备 周四晚上7点来接种—5 ml 试管 周五下午两点来接种—25 ml 三角瓶 2. 酶的诱导合成及其调控 分组进行，实验结束后全班集中整理出总的实验结果 每组： A. 25 ml 基本培养基的三角瓶 B. 21个2 ml 离心管，加入20μl 0.1% SDS和 40 μl 氯仿，盖严后至于冰浴； C. 10个2ml 离心管，测OD600. 第一组：乳糖对β-半乳糖苷酶的诱导 (1). 往25 ml 基本培养基的三角