分子生物实验（副本）.doc

实验一 碱裂解法质粒DNA 一、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，保持可溶性状态而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，它们相互缠绕形成不溶性网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。 、仪器及试剂 1仪器及耗材37℃恒温摇床、台式离心机、微量移液器、1.5 m离心管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 三角瓶、玻棒等。2、试剂 LB培养液溶液溶液溶液70%乙醇、氨卞青霉素贮存液（50 mg/ml） 、操作步骤 大肠杆菌含质粒单菌落于10 ml LB培养基氨卞青霉素37℃振过夜吸取菌液1. mL于1. 5mL离心管中，12000 rpm离心min，弃上清 3、向沉淀的离心管中加0 μL的P1 充分悬细菌沉淀，混和均匀。加250 μL溶液的P2，盖紧管口，上下颠倒离心管透明溶液 5、加0 μL溶液P3，轻微混，置 min，室温12000 rpm离心 min。（加入P3溶液后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清液中还微小白色沉淀则可取上清再离心） 6、将试剂盒中的吸附柱安装到收集管中。将上述操作5中的上清液移至吸附柱中（尽量不要吸出沉淀），12000 rpm离心 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱CP3中加入600 μL的漂洗液PW，12000 rpm离心， μL的漂洗液PW，12000 rpm离心，12000 rpm离心，室温 μL的洗脱液EB，室温12000 rpm离心 11、将离心管底的溶液吸出再次加入到吸附柱膜的中央处，室温12000 rpm离心，－20℃保存。 五、常见问题及可能原因 1提取的质粒DNA不纯：变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。 2提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。 一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。