免疫比浊法检测免疫球蛋白教案.ppt

免疫比浊法检测免疫球蛋白 透射比浊法测定原理 透射比浊法的缺陷： (1)溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大，分子太小则阻挡不了光线的通过。 (2)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。 (3) 透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原－抗体温育反应时间，检测时间较长。 散射比浊法 散射比浊法测定原理 2.终点散射比浊法 散射比浊法的缺陷 (1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确 (2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快速检测。 (3) 终点法存在反应本底，测定样本的含量越低本底比例越大，故在微量测定时，本底的干扰是影响准确测定的重要因素。 影响免疫比浊测定的因素 1、抗原抗体比例 2、抗体的质量 抗体的特异性、效价、亲和力 3、反应的溶液 4、增浊剂的使用 * 免疫学系 实验原理 免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。 免疫比浊法分类 当一束光 线通过溶 液受到光 散射和光 吸收两个 因素的影 响而使光 的强度减 弱 透射比浊法: 在光源的光路方向（00） 测量透射光强度和被检测 溶液微粒浓度关系的方法。 散射比浊法: 在光源的光路方向（50-960） 角的方向上测量透射光强度 和被检测溶液中微粒浓度关 系的方法。 透射比浊法和散射比浊法光路 检测器A 检测器B IC I0 Iθ I θ 透射比浊法 散射比浊法 （一）基本原理 是个极其简单的方法。在抗原过量情况下，与待测样品中相应的Ig发生抗原-抗体反应，形成可溶性复合物，使反应介质的浊度发生改变。 测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以吸收单位（A）或OD值表示，A值反映了入射光和透射光的比率。待测物中Ig含量可通过标准曲线计算得出。 待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射光呈反比。 反应在PEG的作用下，加速复合物的形成。 免疫透射比浊法 光 源 诱导剂 样品 光电计 滤光片 光源 透射比浊法测定原理 光通量是每单位时间到达、离开或通过曲面的光能数量 原理 在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与IC的含量呈正比。 增 加 散 透 率 : 660nm 测 定 散 射 光 聚集形成 诱导剂 散射光测定 检测器 (LED) 光电计 样品 100 % 0 % 时间 散射光强度 速率散射比浊法 （一）基本原理 — 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。 — 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。 — 当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时， 即出现速率峰，该峰 值的高低，即代表所 测抗原的量。 CONCENTRATION RATE 在速率峰基础上完成的标准曲线 方法评价： 敏感度高 快速(不必达平衡） 抗原抗体结合的动态测定，理论上测定不受本底散射信号的影响 可检测微量样品 原理 让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其IC形成的量。IC的浊度不再受时间的影响，但反应IC聚合产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。 1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。 2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。 透射比浊法和散射比浊法优缺点比较 免疫浊度法测定中应注意的问题1、伪浊度的影响?????????? 伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特异性的交叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变质；器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。2、非特异性散射光的影响????? 免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这些非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗体组分在3％以下，散射比浊法需保证在 0.5％以下。??  本实验中应用聚乙二醇的生理特性  聚乙二醇是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇即PEG具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力