第一章 细胞生物学实验-免疫荧光观察细胞骨架.pdf

细胞骨架的免疫荧光标记及定位观察 免疫荧光技术 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫 技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来 的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗 原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进 行标记并获得成功。 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再 用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。荧光素在一定条件下可与 抗体分子结合同时不影响抗体免疫活性的特性。用荧光抗体浸染可能含抗原的细胞 或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原与标记抗体特异性结合，形成的免疫复合 物固定于细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的可见物体，从 而可以对抗原或抗体的性质进行定性、定量和定位分析。常用的荧光素有异硫氰酸 荧光素（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等。 免疫荧光的应用范围极其广泛，可以用于内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、 神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活 性物质的研究。 免疫荧光技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：存 在非特异性染色，结果判定的客观性不足，步骤比较复杂。 免疫荧光技术 免疫荧光分为直接法、间接法和补体结合法。 直接法：将荧光素直接偶联在一抗上，不需要二抗。 1.检查抗原法：这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成 荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即 可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体 只能检查一种抗原，敏感性较差。 2.检查抗体法：将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细 胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。 免疫荧光技术 间接法:先用未标记的特异抗体（一抗）与抗原结合，再用有荧光素标记的抗抗体 （二抗，如抗IgG 的抗体）与标本反应，样品中若有与一抗结合的抗原存在，则会 形成抗原-抗体-抗抗体复合物从而达到染色的目的。 1.检查抗体法：此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特 异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，因为抗原夹在细胞抗体与荧光 抗体之间，故称夹心法。 2.检查抗体法：在样品中加上待检血清，如果血清含有样品中某种抗原的抗体，抗 体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（如抗种属特异性的IgG 荧光抗体）与 结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异 性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。 3.检查抗原法：先用特异性抗体（一抗）与样品反应，再用PBS 洗去未与抗原结合 的抗体，再用间接荧光抗体（二抗）与结合在抗原上的抗体（二抗的抗原）结合， 形成抗原-抗体- 荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著 多于直接法，从而提高了灵敏度。这是现在最广泛应用的技术。 免疫荧光技术 补体结合法：又称抗补体染色法，是间接染色法的一种改良，基于补体结 合反应的原理，通过荧光标记抗补体的抗体，用于鉴定未知抗原或未知抗 体（待检测的血清）。 1. 直接检查组织内免疫复合物法：用抗补体的荧光抗体直接作用于组织 切片，荧光抗体可以和结合在抗原抗体复合物上的补体反应，形成抗 原抗体补体复合物－抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳 性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检 诊断等。 2. 间接检查组织内抗原法：常将新鲜补体与一抗混合后同时加在组织切 片上37℃孵育，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上， 再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原－抗体－抗补体荧 光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种 属来源的一抗的标记显示。 免疫荧光中的抗原和抗体 高特异性的抗体是免疫荧光实验的关键，但是很多的实际研究没有商品化的抗 体，就需要制备免疫血清和纯化免疫球蛋白，需要注意的是： 1. 在抗体制备过程中，用于免疫的抗原必