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第七章 凝胶层析 概述 层析法（也称色谱法）： 早在1903年由俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。 以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。 2.层析法的基本原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 其中固定的称为固定相；流过固定相的称为流动相。 根据层析分离机制 凝胶层析 第一节 凝胶层析的基本原理 第二节 凝胶的结构和性质 第三节 凝胶层析的实验条件和操作 第四节 色谱峰变宽的问题（自学） 第五节 凝胶层析的应用 第一节 凝胶层析的基本原理 一、凝胶层析原理 凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。 二、凝胶层析的重要参数 1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 ⑴柱体积(VA) ：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积(VA)。 ⑵外水体积（V0） ：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用V0表示。 ⑶内水体积Vi ：因凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，水的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括基质的体积（Vg）。 VA=V0+Vi+Vg ??? V柱内空间＝Vo＋Vi 柱床体积VA可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。 VA = 1/4 ?D2h计算 外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。 ⑷峰洗脱体积（淋出体积Ve）：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve表示。 Ve=V0+Vi，ace Vi ，ace是Vi的一部分，它与Vi之比成为Kd（分配系数） Ve=V0+Vi Kd 3. 排阻极限 ?排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。 所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。 例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。 4. 分级分离范围 分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。 例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。 应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。 5. 吸水率和床体积 吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量。 但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。 Sephadex G-X ，X数字代表 1）代表交联度 X越小：交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。 X越大：交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子质量生化产品。 2）代表持水量 每克干胶溶胀时吸水体积的10倍 G-25：1g干胶持水2.5mL G-100：1g干胶持水10mL 3）溶涨时间； 4）凝胶孔径； 5）分离范围 3.性质 稳定性。 能被强酸、强碱和氧化剂破坏，对稀酸稀碱和盐溶液稳定，能耐受一定高温。 存在非特异性吸附 含少量羟基：对阳离子轻微吸附 环状结构：对芳香族化合物和杂环化合物出现滞留 琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品在都以含水状态供应，并应在湿态保存。 一般悬浮在10-3mol/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。 避免硼酸缓冲液 2. 柱的下端口　　 要满足两个要求： 不易阻塞； 死体积小。 玻璃板上铺滤纸 玻璃板下填充小玻璃珠 （二）洗脱与收集 1.洗脱剂 常采用缓冲盐溶液进行洗 脱 洗脱液的成分也不