第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术.ppt

小鼠 羊 兔 牛 玻璃化冷冻卵母细胞作为核受体的体细胞克隆牛 卵母细胞在超低温冷冻中容易受损部位 膜结构 ：质膜内陷、破裂，胞质与透明带相连，微绒毛数量减少或消失，线粒体分散、膨大，内质网囊池扩张，高尔基复合体消失，细胞基质出现空白区等现象。 染色体 ：处于MII期的成熟卵母细胞其染色体松散地附着在纺锤体上，缺少包被的核膜对低温相当敏感。 细胞骨架 对微丝的影响 微丝是由聚合肌动蛋白和自由肌动蛋白组成，它对纺锤体旋转、极体排出、原核迁移和胞质分裂是必需的。正常情况下，两种肌动蛋白保持平衡，但冷冻保存可能破坏这种平衡 对微管的影响 卵母细胞中的微管主要是参与纺锤体形成。正常情况下，胞质中的微管由α管蛋白和β管蛋白结合组成。微管对温度敏感，0~4℃可引起微管的解降， 人腔前期卵母细胞冷冻后细胞质膜破裂 马卵母细胞玻璃化冷冻后细胞质内线粒体变肿大 胚胎的冷冻保存存在的问题与应用前景 冷冻保存的机理尚不十分清楚 冷冻过程中对细胞超微结构损伤机制的研究较少 冷冻后，如何进行定性和定量分析 使用抗冻保护剂对胚胎均有化学毒性，胚胎冷冻、解冻后体外培养或者移植后效果较差，冷冻保存效果有待提高 技术环节有待于简单化和规范化 谢谢！ The End * * 2. 分类 常用的抗冻保护剂可分为两大类： （1）渗透性抗冻保护剂 在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程。由于其容易透过细胞膜，进入细胞后，改变了细胞内过冷状态，使细胞内压接近于外压，降低了细胞脱水引起的皱缩程度和速度，可使细胞内冰核形成的温度下降至-40℃。通常也称作细胞内液抗冻保护剂。 主要 包括：丙三醇（甘油）、丙二醇、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺。 这种冷冻保护剂的特点是：分子量为100以下，能够透过细胞膜。 （2）非渗透性抗冻保护剂 非渗透性抗冻保护剂，可以通过改变细胞膜的通透性，减低冷冻过程中细胞内外的渗透压差，防止由于溶液效应而使细胞脱水及蛋白质变性，在你一定温度下使溶液结冰的部分缩小，从而降低细胞内、外溶质的浓度。通常也称作细胞外液抗冻保护剂。 包括：蔗糖、聚蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清（FCS）、聚乙烯乙二醇（PEG）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 等。 （3）冷冻蛋白 冷冻蛋白(Antifreeze Proteins，AFPS)最初是从极地海鱼中发现的一类抑制冰晶生长的蛋白质，它能通过阻止体液内冰核的形成与生长，维持体液的非冰冻状态，使无体温调节能力的生物在低温的环境里得以生存。 目前，在植物、昆虫、细菌和真菌都发现并分离出冷冻蛋白，应用鱼的冷冻蛋白已成功的玻璃化冷冻了牛和羊的胚胎及猪的卵细胞。 其他一些学者报道，在常规冷冻方法中使用鱼的冷冻蛋白对小鼠囊胚没有影响，而在牛囊胚的玻璃化中使用植物的抗冷冻蛋白并没有使解冻后的胚胎成活率提高，但是，移植后的妊娠率比添加牛血清蛋白的高。 3、减少冷冻保护剂毒性的常用方法包括： ①使生物标本在高浓度的冷冻保护剂中暴露的时间尽可能短、温度尽可能低。 ②选择合适的冷冻保护剂。 ③对某些冷冻保护剂选用特定的毒性中和剂，如在DMSO中加入适量的甲酰胺、乙酰胺可大大降低其生物化学毒性。 高浓度的冷冻保护剂也会导致细胞内外的渗透压差过大。由于冷冻保护剂穿透细胞膜的速率比水要小，因此加载冷冻保护剂的最初反应是细胞内水分的渗出，同样，在生物标本中移出冷冻保护剂时，细胞外的水分要渗入。 尽管细胞内外的水分、冷冻保护剂相互渗透并最终达到平衡，细胞体积的过度变化将导致细胞失活。 因此在玻璃化冷冻保存细胞、组织的过程中应逐步加载、移出冷冻保护剂，以减少细胞内外的渗透压差。 要实现玻璃化冷冻保存，需要针对不同的生物标本对冷冻保护剂的种类，浓度进行筛选并确定相应的加入、移出方式。 4、除去冷冻保护剂的方法： （1）、逐步稀释法 用浓度递减的保护液逐步稀释，使冷冻保护剂脱除。此方法比较繁琐，但效果好，目前普遍采用此方法。 （2）、非渗透性溶液脱除法 应用较高浓度的非渗透性保护液经一步或两步脱除保护剂。将解冻后的胚胎移入含有高浓度的非渗透性保护液中，有助于脱除冷冻保护剂而不产生新的渗透性损伤。此法常以蔗糖作溶质，蔗糖是非渗透性双糖，在稀释细胞内保护剂时起缓冲渗透压的作用，防止水分大量渗入细胞而引起过度膨胀。 （3）、细管内脱出冷冻保护剂 1983年SP.Leibo等提出一步细管法，冷冻时将冷冻保护剂及解冻液定量分装在细管内的不同部位，解冻时使胚胎解冻和脱除冷冻保护剂一步完成，解冻后可直接进行移植。 目前人们对这一方法继续进行研究，试图找出无需脱除即可直接移植的冷冻保护剂。 对于玻璃化冷冻的胚胎，在细管中间装入三段玻璃化液，中间段含胚胎，其余部分为稀释液。解冻后手捏封口端摇晃均匀，然后