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第二章 DNA克隆技术 克隆羊： 个体水平 细胞克隆： 细胞水平 DNA克隆： 分子水平 单克隆抗体： 分子水平 2、DNA重组/ 基因重组 利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。 3、DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克隆 将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。 遗传学角度：一项遗传学技术 将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，创造生物新品种或新物种的遗传学技术 无性繁殖：称之为“克隆” 行使正常功能：称之为“表达” 生物化学角度：重组载体的操作 在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。 DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的 载体DNA ：病毒、细菌质粒或噬菌体 第一节 概论 一、历史 1944 肺炎双球菌转化实验 —— DNA是遗传物质 1953 DNA双螺旋模型 —— DNA复制的机制 1960’s 遗传密码 —— 中心法则 1970 反转录酶 —— cDNA的合成 1946- 质粒 —— 重组载体 1968-70 限制酶 —— 工具酶 1972 Berg重组DNA分子 1973 Cohen重组DNA的转化筛选 The transforming principle is DNA. History of DNA cloning History of DNA cloning History of DNA cloning 二、基因克隆的特点和技术路线 1、特点： 分子水平上操作，细胞水平上表达 2、技术路线： 分：分离制备目的DNA片段和载体 切：目的DNA与载体的剪切 接：目的DNA与载体的连接 转：重组DNA分子转化宿主细胞 筛：筛选阳性克隆，大量扩增 基因克隆技术路线 第二节 工具酶 工具酶： 基因克隆研究工作中，用以切割、连接和修饰DNA或RNA的一类酶，是克隆的基本工具。包括核酸限制性内切酶、连接酶、聚合酶、反转录酶等。 2、命名 酶的来源 Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系 酶的名称 Hind Ⅰ 特异性甲基化酶 Ⅱ GTPy PuAC Ⅲ A AGCTT 3、分类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ DNA底物 双链DNA 双链DNA 双链DNA 辅因子 Mg2+ ATP SAM Mg2+ Mg2+ ATP 识别序列 特异 特异 特异 切割位点 非特定 特定 特定 识别序列前后 之中 之后25bp~27bp 100-1000bp 修饰作用 有 无 有 4、特点 Ⅱ型限制酶： 4~8个核苷酸 切口概率 星号活力 回文结构 平端切口 粘性末端 二、聚合酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶） 2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大片段 Klenow 3、T4噬菌体D