10.3、SDS-PAGE.pdf

生物活性分子的分离与表征生物活性分子的分离与表征 第三部分 鉴定技术 第10章、电泳技术 第第1111章章、定量分析技术定量分析技术 第第12章章、、组分分析技术组分分析技术 第13章、生物活性测定技术 第第1010章章 电泳技术电泳技术 10.1、电泳技术概述 1010.22、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 10.3、、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 10.4、等电聚焦电泳 10.5、双向电泳双向电泳 10.3、变性聚丙烯烯酰胺凝胶电泳泳 （sodium-dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ，SDS） 10.k.1、基本原理 10.k.2、SDS类型 1010.kk.33、电泳条件的选择电泳条件的选择 10.k.4、实验方法 10.k.5、相对分子量的测定 SDSSDS‐PAGEPAGE基本原理基本原理 SDSSDSPAGE即十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺即十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺 凝胶电泳，根据SDS和还原试剂将蛋白质分子 解聚后解聚后亚基亚基的大小的大小，在恒定在恒定pHH （（碱性碱性））缓冲缓冲 系统中的分离。 主要用于测定蛋白质亚基的分子量。 11 .蛋白质分子的结构蛋白质分子的结构 22、蛋白质分子的解聚蛋白质分子的解聚 SDS作用作用：SDS在水中带负电荷在水中带负电荷，可以使蛋以使蛋 白质分子间氢键断裂，使分子去折叠，破坏 其二级和三级结构。 还原剂作用： β巯基乙醇和二硫苏糖醇 （（DTT）），可以使蛋白质中半胱氨酸残基之间可以使蛋白质中半胱氨酸残基之间 的二硫健打开解聚形成单链分子。 在样品和凝胶中加入在样品和凝胶中加入SDSSDS和还原剂和还原剂后后，在在100100 ℃保温3-5分钟，分子被解聚为多肽链。 解聚后的氨基酸侧链与解聚后的氨基酸侧链与SDSSDS充分结合形成带充分结合形成带 负电荷的蛋白质一SDS胶束，所带的负电荷大大 超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不 同分子之间原有的电荷差异同分子之间原有的电荷差异。 三种不同性质蛋白质的电泳比较： QuaternaryQuaternary MolecularMolecular MobilityMobility Protein pI Native SDS- Structure Weight PAGE PAGE X Tetramer (40,000)x4 5.8 Slow Fast YY Monomer 88,000 5.2 Fast Slow Z Monomer 60,,000 9.3 Uppward Medium X - Y - Z + NativeSDS X Y Z + SDS X Y Z - - + + 分子量及净电荷密度 只有分子量影响迁移率 均影响迁移率 33、影响影响SDSSDS‐蛋白复合物形成的因素蛋白复合物形成的因素 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特 别是样品制备过程中蛋白质与别是样品制备过程中蛋白质与SDSSDS的结合程