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辉骏生物 Fitgene SDS电泳 FAQ 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进 可能减少其相互间的聚集，最常用的就是 SDS电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些 讨论： Q ：SDS电泳的基本原理? A ：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠) ，SDS 会与变性的多肽， 并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此 SDS 多肽复 合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4g 去污剂结 合。当分子量在 15KD 到200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX ， 式中：MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图， 可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 Q ：配胶缓冲液系统对电泳的影响? A ：在SDS不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris-HCL 缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7 ，分离胶pH8.9; 而电泳缓冲液使用的 Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电 场的作用下，泳动效率低;而 CL 离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄 的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离 子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首 要考虑该因素。 Q ：样品如何处理? A ：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。 1、还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT(或 Beta 巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和， 形成 SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当 浓度，加入上样 Buffer ，离心，沸水煮5min ，再离心加样。 2、带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄 的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT ，而防止银染时的纹理现象。100μl 样品缓冲液中 10μl 20%的碘乙酸胺， 并在室温保温 30min。 1 辉骏生物 Fitgene 3、非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1%SDS 沸水中煮 3min ，未加还原剂，因而蛋 白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 Q ：SDS电泳凝胶中各主要成分的作用? A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及 环境密切相关; 制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7 ，分离胶选择pH8.9 ，选择tris-HCL 系统，具体作用后面介绍; TEMED 与 AP ：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固; 十二烷基硫酸钠(SDS) ：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的 疏水作用、去多肽折叠。 Q ：提高SDS电泳分辨率的途径? A ：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段 时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下 保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。 2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料 ，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君 编著的《蛋白