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博奥生物公司关于基因qRT-PCR的过程 博奥生物有限公司 博奥生物有限公司 生物芯片北京国家工程研究中心 生物芯片北京国家工程研究中心 qRT-PCR定量检测原理 常用的qRT-PCR技术大致可以分为2类：一类是以SYBR 常用的qRT-PCR技术大致可以分为2类：一类是以 Green为代表的非特异性荧光标记；另一类TaqMan为代 表的特异性荧光标记。 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan SYBR Green法工作机理 SYBR Green能结合到双链DNA的小沟部位，只有当SYBR Green和双链DNA结合后才发荧光。 当DNA变性时，DNA双链解螺旋，无荧光信号；当DNA复 性和延伸时，形成双链DNA结构，SYBR Green插入DNA 而发荧光，因此必须在复性阶段采集荧光信号。 SYBR Green TaqMan探针的工作原理 TaqMan探针： TaqMan探针：5′端标记有报 告基团(Reporter, R) ，如 FAM、VIC等 ；3′端标记有 荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 若探针完整，R所发射的荧光 与目标序列互补 能量被Q基团吸收 ，无荧 光；若R与Q分开，发荧光。 Taw酶有 5′→3′外切核酸 酶活性，可水解探针，释放R 产生荧光信号。 每扩增一条DNA分子，释放一 个荧光信号，可以在环过程 中任一点检测荧光。 SYBR Green和TaqMan探针技术比较 SYBR Green方法检测的特异性由正向和反向的一对引 SYBR Green方法检测的特异性由正向和反向的一对引 物决定，容易受到非特异性扩增影响。但该方法通用 物决定，容易受到非特异性扩增影响。但该方法通用 性好，检测成本比较低。 性好，检测成本比较低。 TaqMan探针技术检测的特应性不仅由扩增引物决定， TaqMan探针技术检测的特应性不仅由扩增引物决定， 还由TaqMan探针决定，因而对非特异性扩增的区分能 还由TaqMan探针决定，因而对非特异性扩增的区分能 力更好。但TaqMan探针合成非常昂贵，一条探针都要 力更好。但TaqMan探针合成非常昂贵，一条探针都要 在千元以上，限制了其应用。 在千元以上，限制了其应用。 这两种检测方法都一般都需要每个检测进行3次技术重