系学术沙龙 梁荣奇2014-6-30.ppt

* * * 羧酸酯酶（Carboxylesterases) 是一个多功能酶系，其活性中心含有Ser残基，能够有效的水解酯类（羧酸酯类和硫酯类）、酰胺类化合物。在昆虫体内是代谢有机磷等杀虫剂的主要解毒酶，部分具有水解活性的a-酯酶或?-酯酶基因在昆虫触角中表达，可以降解性信息素和其他外源气味分子。而Ser203，Glu336（Glu instead of Asp for some lipases） 和 His450 残基构成该酶的催化中心，并且 Glu336 与 His450 之间形成氢键，防止亲核基团攻击其底物上的 Ser203[26]。 Gly124-Gly125 构成氧离子洞的组成成分[27]。（2）分子内均有 4 个左右的半胱氨酸残基(Cys)，构成两对二硫键以维持活性中心的空间构型；在很多羧酸酯酶中 Cys98 是最保守的残基。（3）近 N 端有一糖基化位点。糖链对糖苷酶 H 非常敏感，提示含甘露糖较多。糖基化程度与酶的活性呈正相关，说明该糖基化位点可能与酶的稳定性或活性位点的空间结构有关；（4） C 末端序列保守的序列 HIEL-COOH 或 HTEL-COOH 是羧酸酯酶在内质网腔潴留的信号，该信号和内质网潴留受体(ERD2)共同作用保证内质网蛋白的潴留 羧酸酯酶基因：羧酸酯酶是一个多功能酶系，能对内源性和外源性酯类化合物进行水解，其活性中心是有高度保守的Ser203，Glu336和His450残基形成（Cygler et al. 1993） 。 * 不同龄期麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量存在较大差异，即随着蚜虫龄期增加羧酸酯酶基因的表达量而上调；2龄、3龄、4龄和成虫羧酸酯酶基因表达量比一龄幼虫分别上调33%、53%、156%、303%。 * 由图5-16可以看出，用100ｕmol/L和200ｕmol/L的辛硫磷溶剂都能使麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量比对照增加；100ｕmol/L的辛硫磷溶剂使麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量比对照上调34.4%；200ｕmol/L的辛硫磷溶剂使麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量比对照上调78.2%，比100ｕmol/L的辛硫磷溶剂增加了1倍。 * 通过同源克隆获得麦长管蚜羧酸酯酶基因部分片段。 * * 通过一系列过程构建了RNAi表达载体，该载体包括rbcs启动子，FAD2Intrl内含子。经过筛选，分化，生根壮苗等获得转基因株系dsCbE1-5和dsCbE2-2. * 利用qRT-PCR技术分析食喂在转基因株系dsCbE1-5和dsCbE2-2上1天、3天、5天的麦长管蚜羧酸酯酶基因的表达量；由图5-17可以看出，麦长管蚜取食dsCbE1-5叶片1天后，其羧酸酯酶基因表达量比对照降低，但是未达到显著水平；而麦长管蚜取食转基因株系dsCbE2-2叶片后1天后，麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量比对照显著降低。 * 由图5-20可以看出，蚜虫取食转基因株系dsCbE1-5和dsCbE2-2第3天后，其羧酸酯酶活性比对照显著降低，第5天后，其羧酸酯酶活性更低。 * 由图5-21可以看出，用转基因株系食喂麦长管蚜15天后，转基因株系dsCbE1-5和dsCbE2-2上的蚜虫数量比对照显著降低。 * 由图5-21可以看出，用转基因株系食喂麦长管蚜15天后，转基因株系dsCbE1-5和dsCbE2-2上的蚜虫数量比对照显著降低。 * * 今天汇报主要内容有： 立论依据以及研究现状 小麦品种（系）的抗蚜性初步研究 小麦灌浆期抗麦长管蚜生理机制的研究 利用植物介导的RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因、脂蛋白酯酶基因和嗅觉相关蛋白Gqa基因 结论 * * 取麦长管蚜成虫，按照美莱博RNA提取试剂盒提取总RNA（图6-1）。图中，28S、18S都很清晰，说明提取的总RNA可以用于RT-PCR。利用引物SaLPL-s1和SaLPL-a1得到0.543Kb左右的LPL目的片段（图6-2），将该目的片断连接到了pGEM- T easy载体上，并命名为pTE-LPL 。 * 取图6-3中1、2、3、4、5、7、8、11泳道的重组质粒测序。对泳道5质粒（命名为pTE-LPL）双向测序的结果表明（图6-4），插入pGEM- T easy载体的PCR片段约0.543kb，结果表明，目的基因与豌豆蚜（GenBank：XM-0019507372）相似性为86.79%；与豌豆蚜（GenBank：XM-001944358.2）序列相似性为75.37%；与豌豆蚜（GenBank：FF314537）的序列相似性为78.86%，测序序列用于RNAi 载体构建。 * 插入pGEM-T Easy载体的PCR片段约0.533kb，双向测序的结果表明（图6-17），与麦长管蚜序列（GenBank：EF638906）mRNA同源性达到98.1%，说明该片