细胞培养工艺介绍.ppt

优化考察指标——生长状态 优化考察指标 生长曲线 表达水平 优化效果 工艺控制 细胞状态的观察 工艺参数的设定 液体补充的控制 发酵模式 批次培养 补料－批次培养 连续灌注培养 培养放大 方瓶 摇瓶 小罐 大罐 …… 优化空间 培养控制 搅拌 通气 营养补充 培养监控 pO2 温度 生化参数 营养消耗 表达监控 搅拌 通气 pH 密度 活率 提纲 为什么要培养细胞 培养什么样的细胞 如何培养细胞及培养过程的注意事项 为什么要培养细胞－生命科学的基本研究方法 科学研究需要——细胞是生物体的最小单位 工业生产的需要——细胞培养可以获得我们需要的药物、原料等 单克隆抗体 市场快速增长 08年销售达167亿美元 已有近20个产品 超过150个在临床试验阶段 主要是CHO表达的，超过50％ 现状 高需求量：数千公斤 国外水平：1-10g/L 国内水平：1g/L 培养何种细胞 表达我们目的蛋白的细胞——处理过CHO细胞 基本概念 DNA——染色体——遗传物质 基因——DNA片断 转录：DNA——RNA 翻译：RNA——蛋白质 构建表达特定产物的细胞株 将特定产物的基因引入细胞中 长期稳定表达 挑选克隆 CHO 阳性克隆 将外源基因到入细胞内 可选的细胞 构建的表达载体 转染的方法 克隆的挑选 表达产物的检测 常用的表达细胞 CHO NSO SP2/0 Hybridoma 常用的表达体系 GS表达系统 DHFR表达系统 表达载体的作用 让细胞产生抗性 同时表达目的蛋白 谷氨酰胺合成酶基因表达载体（GS） 谷氨酰胺是细胞生命必需物质 部分细胞不能合成谷氨酰胺，或合成不足 载体中含有谷氨酰胺合成酶的基因 在不含谷氨酰胺的培养基中，只有整合了谷氨酰胺合成酶基因的细胞存活 加入筛选剂－MSX，增加其表达量 二氢叶酸还原酶表达系统（DHFR） DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶 常用DHFR-的CHO细胞不能合成四氢叶酸 含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基 在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达水平，使外源基因高效表达 转染方法 脂质体：融合细胞膜 磷酸钙：形成沉淀，细胞内吞 电穿孔：膜上打孔，自由出入 为什么要挑选克隆 稳定的种子 高效的种子 经过验证的种子 克隆就是从一个细胞增殖形成的细胞群 细胞筛选方法－获得单克隆 贴壁培养的克隆形成 克隆环 ClonePix FL Cell Xpress 有限稀释法单克隆形成 流式细胞术筛选细胞 Re-clone subclone 检测手段 dot-blot ELISA SDSWestern Flow Cytometry Analysis dot-blot 上清 酶连抗体（1步或2步） 显色剂 酶联免疫吸附试验（ELISA） 夹心法 包被抗体 加上清 酶联抗体 显色 读数 SDS分子量与泳动距离 SDS带电，与蛋白结合 染色：溴酚蓝、银染等 定性及定量检测 Western 基于电泳 转膜 抗体及酶（同ELISA） 染色或发光 Flow Cytometry Analysis 抗体与细胞结合 荧光物质连接抗体 激光诱发荧光 可检测上清或细胞 高表达克隆的确定 构建表达载体 转染细胞 单克隆 上述筛选 重复克隆及筛选 保留3－5个克隆 如何培养细胞 无血清、悬浮培养 培养细胞的方法 含血清培养 无血清培养 价格便宜 品质稳定 生物污染少 减轻下游纯化负担 贴壁变悬浮 贴壁 悬浮 平面 立体 血清替代 氨基酸 维生素 生长因子 微量元素 脂类成分 无血清培养基的分类 无血清培养基 无蛋白培养基 化学成分限定型培养基 无血清、无蛋白、化学成分限定型培养基 无动物源性成分 优化培养——如何优化？ 细胞株的选择 培养条件优化 工艺调整 为什么要优化？ 细胞株的选择 细胞株的选择 培养条件优化 主要是培养基的优化 培养基的成分 培养基的使用方法