菠萝蛋白酶测定实验报告.doc

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 14食安（5）班 马俊宇201430520516 摘要：本次实验通过对菠萝皮中存在的菠萝蛋白酶进行粗提取、盐析和透析从而纯化和分离；并采用考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质的含量，利用菠萝蛋白酶水解酪蛋白后的水解产物酪氨酸，在280nm处吸光值的高低，判断酶活性的大小。从实验结果看出，纯化程度越高，提取液中蛋白质的含量先降低，后升高。同时，实验测得菠萝蛋白酶的比活力、回收率随纯化程度的提高而先升高后降低。 关键词：菠萝蛋白酶 纯化 酶活性 蛋白质含量 前 言 菠萝蛋白酶主要分布于菠萝的茎和果实中，能分解蛋白质、肽、脂和酰胺，具有较高的生物活性，在各个生产领域中得到广泛的应用[1]。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能[2]。菠萝萝蛋白酶 p H 在 4.0~5.5处于较稳定的状态，在中性环境中酶活保持最高，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活[3]。本实验研究粗提取、盐析和透析所得到的菠萝蛋白酶提取液中的蛋白质含量、酶活性高低、回收率和纯化倍数等，对酶的纯化情况进行研究。 1 实验材料与仪器 1．1 实验材料与试剂 新鲜菠萝（3个），盐析粗提液（PBS），酪蛋白试剂，激活剂，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，乙醇 1．2 实验仪器 电子天平，台式天平，恒温水浴锅，冰箱，高速离心机，分光光度计，研钵，烧杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，滤纸，试管，试管架，滴管，玻璃棒，纱布，洗耳球，标签纸，橡皮筋 DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂 HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 2 实验方法 2．1 菠萝蛋白酶的粗酶提取 称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高 速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。 2．2 盐析 根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm离心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。 2．3透析 将溶解液装入2.5 cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于 500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42- 未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。 2．4 酶活力测定方法 取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下 ，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。 实验步骤按照表格1中完成。 试剂(ml) 对照组 平行样品1 平行样品2 平行样品3 TCA 3 — — — 酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 激活剂 0.9 0.9 0.9 0.9 酪蛋白 1 1 1 1 37°C准确反应10min TCA — 3 3 3 A280nm OD值 表格1 3实验结果与分析 根据上述实验步骤，测得粗提取、盐析、透析得到的酶制剂在280nm处的吸光值如下表2示 A280nm 对照组 平行样品1 平行样品2 平行样品3 粗提取 0 0.523 0.501 0.433