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菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定要点
14食安(1)班 赖玉健 201430520106 孙涵治 201430520119 杨泽杰 201430520124 熊渠 201430560525 14食安(5)班 李炽斌 201430520510
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菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定
14食安(1)班 杨泽杰
摘要:本文结合考马斯亮蓝G250染色法,研究了不同纯化方法,包括硫酸铵沉淀法、透析法,对菠萝蛋白酶活性的影响。实验结果表明,两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶,但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。
关键词:菠萝蛋白酶 沉淀法 透析法 纯化 酶活性
前 言
菠萝蛋白酶(Bromelain,EC 3.4.22.3)简称菠萝酶,是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶,它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白,是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物,因含有一个不稳定的游离巯基,所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000,等电点 9.55,最适pH在7.1左右,在偏酸环境下酶活下降较快,碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大,维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂,EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶,有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂,能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等,可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症,它能帮助迅速结痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
1 实验材料与仪器
实验材料与试剂
1.1.1 实验材料
新鲜菠萝(3个),透析袋
1.1.2 实验试剂
(1)盐析粗提液
0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制(PBS)(配4 000mL),0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制(PBS)(配4 000mL)
(2)酶活力测定试剂
1%酪蛋白(进口分装)(配100mL),激活剂[含20mmo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)] ,10%三氯乙酸(TCA)
实验仪器和用品
实验仪器
HJ-6多头磁力搅拌器:常州国华电器有限公司
MC-H18S012多功能红外炉:广东美的生活电器制造有限公司
DS-1高速组织捣碎机:上海标本模型厂
GKC110R2可控硅恒温水浴锅:赏花锦屏仪器仪表有限公司
TD5M低速离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司
TDL-60B台式离心机:上海安亭科学仪器厂
722型可见分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司
UV5100B型紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司
PL1502-S电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司
BCD-539WT冰箱:青岛海尔股份有限公司
实验用品
(1)以组为单位的用品
大试管18mm×200 mm(10支)、试管架(2个)、烧杯(50mL×1,100mL×2, 200mL×1)、滴管(2支)、玻璃棒(2支)、移液管(5mL×1,1mL×2,0.1mL×1,0.2 mL×1)、漏斗(3个)、量筒 (100mL×1)、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。
(2)全班共用的用品
试剂瓶(1000mL×7,250mL×3,60mL×20)、烧杯(1000mL×4)、塑料烧杯(2000mL×2)、量筒 (500mL×2,1000mL×2)、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋(截留相对分子质量8 000~14 000)。
实验方法
菠萝蛋白酶的粗酶提取
称取菠萝皮材料30g,将菠萝皮在清水中洗净,沥干,切成小段后置于超高速搅拌机中,加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS,持续搅拌10~15min至粉碎,搅拌完成后用4层纱布过滤,得到滤液后,用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min,弃沉淀,即得到菠萝蛋白酶粗提液,测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性[1]。
盐析
根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”,按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量,称取固体硫酸铵于研钵中,研磨呈粉末,慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵,边加边搅拌,使溶液最终硫酸铵饱和度为30%,放置于冰水混合物(4℃)30min 后,酶蛋白沉淀析出,4°C 4000rpm离心10min,收集沉淀, 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解,测定其体积、蛋白质
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