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免疫磁珠富集净化-超高效液相色谱法同时测定陈皮中4 种黄曲霉毒素;文献信息;摘要：;实验结果表明，4 种黄曲霉毒素在各自的线性范围内峰面积与其质量浓度线性关系良好，相关系数（ｒ2）大于0.999；检出限（信噪比为3）为0.013~ 0.038 μｇ／ｋｇ，定量限（ 信噪比为10）为0. 044~1.2 μｇ／ｋｇ；平均回收率为63.9％ ~115.0％ ，相对标准偏差为0.4％ ~ 14.2％ ，均符合痕量分析的要求。该方法简单快速、准确可靠，可用于陈皮中4种黄曲霉毒素的测定。 ;背景;致癌物的等级可分为第一级(Group 1)致癌物、第二级A类(Group 2A)致癌物、第二级B类(Group 2B)致癌物、第三级(Group 3)致癌物三个级别。黄曲霉毒素属于第一级致癌物;黄曲霉毒素的产生： 目前报道的ＡＦｓ有20多种，中药材在采收、贮存、加工和炮制过程中处理不当易被ＡＦｓ 污染，较常见的有黄曲霉毒素Ｂ1（ＡＦＢ1）、黄曲霉毒素 Ｂ2（ＡＦＢ2）、黄曲霉毒素 Ｇ1（ＡＦＧ1）、黄曲霉毒素 Ｇ2（ＡＦＧ2），其中 ＡＦＢ1 的毒性最强。 黄曲霉素是黄曲霉菌属黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的代谢物，剧毒，同时还有致癌、致畸、致突变的作用，主要引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。 ;;;黄曲霉毒素的检测过程;AFs的前处理：;免疫磁珠分离技术;免疫磁珠分离技术的原理;AFs的检测方法;ＬＣ-ＭＳ 联用法能够同时进行定性和定量分析，能有效排除假阳性结果，但仪器昂贵，不易推广。 ＵＰＬＣ 法借助于ＨＰＬＣ 法的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、低系统体积及快速检测手段等全新技术。 ＵＰＬＣ与传统的ＨＰＬＣ法相比，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量，降低了分析成本。;检测器;实验部分;黄曲霉毒素Ｂ1、Ｂ2、Ｇ1、Ｇ2 混合标准溶液； 抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体，AFT； ＰｒｏｔＥｌｕｔ ＮＨＳ（Ｎ-羟基丁二酰亚胺）偶联磁珠； 牛血清白蛋白（ＢＳＡ）； 考马斯亮蓝Ｇ-250 染料试剂； 甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。 实验用水超纯水。;实验方法;;;结果与讨论;;ＮＨＳ 磁珠与ＡＦＴ 的偶联 ＮＨＳ 磁珠外表面的ＮＨＳ 基团与ＡＦＴ 的伯氨基团反应，形成Ｃ-Ｎ 共价键，实现ＡＦＴ 与磁珠的共价偶联。利用此原理，本实验成功将ＡＦＴ 偶联到ＮＨＳ磁珠表面。 采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ 蛋白定量法测定抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体和ＮＨＳ 磁珠的偶联效率（ 以ＢＳＡ 为标准物绘制Ｂｒａｄｆｏｒｄ 标准曲线），平均偶联率为99％，由此说明1 ｍｇ ＡＦＴ 基本全部被60ｍｇ ＰｒｏｔＥｌｕｔ ＮＨＳ 磁珠偶联。;免疫磁珠富集净化条件的优化 免疫磁珠富集净化的温度与ｐＨ 值 免疫磁珠富集净化使用的抗原、抗体多在15 ~40 ℃范围内反应，过高的温度会使抗原、抗体失活。 抗原和抗体的结合反应必须在合适的ｐＨ 值环境中进行，一般ｐＨ 值为6~8。ｐＨ 值过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，ｐＨ 值达到或接近抗原的等电点时，即使无相应的抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。常用的抗原、抗体反应ｐＨ 值为7. 4，而保存ＡＦＴ 的ＰＢＳ 缓冲溶液ｐＨ 值也为7. 4，因此免疫磁珠净化体系的ｐＨ 值定为7. 4。;免疫磁珠的使用量 免疫磁珠富集净化样品时，吸附是关键步骤，为更好地控制免疫磁珠对ＡＦｓ 的吸附量，本文对免疫磁珠的使用量进行了优化。;免疫磁珠富集净化的时?? 在ｐＨ 7. 4 及室温条件下，考察了不同富集吸附时间下免疫磁珠对4 种ＡＦｓ 的富集净化效果。;免疫磁珠的洗脱体积与洗脱时间 为了确定洗脱液甲醇对免疫磁珠的洗脱体积与洗脱时间，分别使用400、800、1 000、1 200 μＬ 甲醇对免疫磁珠进行洗脱。;色谱条件的优化 文中采用不同比例的甲醇-水系统等度和梯度洗脱分离陈皮样品中的4 种ＡＦｓ 对陈皮样品中4 种ＡＦｓ 的分离情况。;;;;方法学考察 专属性 线性范围和相关系数 检出限和定量限 仪器精密度 稳定性 加标回收率和重复性;;;样品测定 采用本文建立的方法分别测定6 批陈皮样品，均未检出黄曲霉毒素。为了排除假阴性结果，采用高效液相色谱-串联质谱法对该6 批陈皮样品进行结果复核实验。结果表明6 批陈皮样品均不含4 种ＡＦｓ。同时也证明了本文建立的方法准确可靠。;结论;提问与互动;谢谢！