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第十一章 原生质体培养和体细胞杂交 第一节 原生质体培养 第二节 原生质体融合 第三节 以原生质体为材料的基础理论研究 本章教学目的与要求 (1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方凑。 第一节 原生质体培养 第一节 原生质体培养 1 概念： 1.1 原生质体（Protoplast） 指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。 1.2 原生质体培养 指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。 1.3 原生质体培养的用途 作为一个良好的实验系统，应用于植物细胞骨架、细胞壁的形成与功能、细胞膜的结构与功能、细胞分化与脱分化等重大理论问题的研究。 作为植物生物技术的一个重要分支，应用于外源基因转移、体细胞杂交、无性系变异及突变筛选。 2 设备与用具 除了组织培养的设备与用具之外， 一些专门的仪器和用具： 2.1 倒置显微镜、荧光显微镜及照相设备 血球计数板：检查原生质体或细胞培养密度。 倒置显微镜: 观察培养皿、培养瓶或三角瓶中的培养物。 荧光显微镜 ：检查原生质体活性及去壁情况时，用荧光染料染色后观察。 显微照相设备：记录原生质体和细胞的生长状态。 2.2 细菌过滤器 酶液和植物激素不能高温高压灭菌。 用孔径为0.45um的滤膜滤去细菌和病毒。 抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌， 也可用注射器推压过滤灭菌。 2.3 离心机 分离提纯原生质体用500转／分离心3~5min， 制备酶液用2500转/分离心10min以除去残渣。 第一节 原生质体培养 3 化学试剂 3.1 无机化学试剂 分析纯试剂 3.2 有机化学试剂 1）维生素 泛酸钙（维生素B5）、叶酸、维生素A、维生素C、维生素D、生物素、氯化胆碱、对甲基苯甲酸等。 配制母液时先制备各个组分的贮液。 2）激素 与组织培养的基本相同 3）渗透压稳定剂 用来保持原生质体的稳定。 采用糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 浓度：0.4-0.8mmol.L-1 原生质体容易吸收葡萄糖，而蔗糖对于原生质体培养不利。 4）碳源和氮源 最常用的碳源是葡萄糖和蔗糖。 有机氮源:水解酪蛋白、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸等。 3.3 凝胶剂 除使用琼脂粉外，还有琼脂糖和一些国外同类产品，如日本的Gellan Gum。 4 酶类 植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶三种主要成分构成。 第一节 原生质体培养 5 原生质体的分离与纯化 5.1 外植体的选择 注意条件： 选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。 植物的年龄、季节、光照、肥水条件等都明显影响原生质体的质量。 多数植物以叶肉细胞，根、下胚轴、幼叶、子叶等，温室植株较好。 禾本科植物：愈伤组织和悬浮细胞。 最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。 对植株进行预处理，可提高原生质体培养中的分裂频率。 预处理的方式: 暗处理、低温处理或预先在培养基上进行预培养。 5.2 外植体灭菌 与组织培养中的外植体灭菌相同。 5.3 酶解处理 1) 使用浓度和酶解时间 酶液的浓度和酶解时间因不同材料有所不同，一般需要经过预实验来确定。 酶的选择也因材料而异，愈伤组织和悬浮细胞可用活性较强的酶如纤维素酶Onozuka RS和果胶酶Pectolyase Y23等，酶的浓度也大些。 而叶片等材料，酶的浓度可小些。 表 几种酶液的组成成分 2) 酶解条件 黑暗、静止，振荡，以促进酶解。 酶解时间因材料而不同。 不要超过24h，时间太长不利于原生质体，对以后培养中的细胞生长和分裂有影响。 温度25~27℃。 3) 渗透浓度 应试验不同渗透压浓度的细胞反应，找出适宜的渗透浓度。广泛使用的山梨醇和甘露醇浓度为0.4~0.8 mol·L-1。 5.4 原生质体的收集和纯化 过滤和离心的方法进行收集和纯化。 过滤: 用40~100目去除杂质。 离心：75~100g离心3~5min，弃去上清液， 纯化： 1）再离心：先悬浮在洗液后离心，重复三次。 2）培养基清洗，离心，提取。 调原生质体培养密度:104-106/ml。 2) 染色识别 用0.1%酚番红或伊凡蓝或荧光素双醋酸（FDA）染色,有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。 第一节 原生质体培养 6 原生质体培养 6.1 培养基 ⑴ 培养基成分：KM－P；N6。 ⑵ 渗透压稳定剂：葡萄糖最好。随胞壁再生和细胞持续分裂，其浓度须不断降低，有利生长。 ⑶ 无机盐：降铁、增钙、