1基因工程的酶学基础.pptx

基因工程的酶学基础;;核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶(RNase)，而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶(DNase)。 按水解断裂核酸分子的方式不同，可分为两种类型： 一类是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫核酸外切酶(exonuclease)； 另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫核酸内切酶(endonuclease)。;;2. 性质;限制/修饰系统 (R-M, Restriction-modification system); 寄主控制的限制与修饰的机理 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。 ; 寄主控制的限制与修饰机理 　修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。 ;甲基化酶：甲基转移酶 ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG 第二个C上C5位置上引入甲基 ;限制/修饰系统;;寄主控制的限制与修饰的作用: 　　　一是保护自身的DNA不受限制； 　　　二是破坏外源DNA使之迅速降解。 基因工程中，应采用缺少限制作用 的菌株作为受体。;;首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。;需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。;2. III型限制性内切酶 ;1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先从流感嗜血杆菌d株中分离出来。 ;识别序列;EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端;（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）;EcoR I等产生的5‘粘性末端;CTGCA?G ;Pst I等产生的3‘粘性末端;① 连接便利 ;;③ 补平成平齐末端;Pvu II等产生的平头末端;识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ;Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’ 3’-GGG?CCC-5’ ;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 ;;限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 ;EcoR I和BamH I等都有*活性。;在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。;特性;限制性内切酶的命名原则:;EcoR I;影响限制性内切核酸酶活性的因素;（一）酶的纯度 高质量的限制性内切核酸酶应是通过全面提纯的，不存在其他内切核酸酶或外切酶的污染 在长时间酶解时不出现识别序列特异性的下降 酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等。 ;（二）DNA样品的纯度;（三）DNA的甲基化程度 原核生物细胞内存在限制-修饰系统，其中甲基转移酶(Mtase)对DNA起修饰作用，从而使自身DNA不受体内限制性内切核酸酶的切割。 甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性 为了克服甲基转移酶(Mtase)的影响，在基因克隆中使用MTase缺失的菌株来制备质粒DNA。 ;（四）酶切反应的温度 消化DNA分子时，不同的REase具有不同的最适反应温度。 对于大多数限制性内切核酸酶，最适反应温度为37℃，但也有例外。 例如，SmaI、ApaI、BclI、MaeIII、TaqI的最适反应温度分别是25℃、30℃、50℃、是55℃、65℃。 酶切反应时低于或高于最适温度，都会影响酶的活性，甚至使酶失活。 ;（五）DNA分子的构型 底物DNA分子的构型会对限制性内切核酸酶的活性产生明显影响。 例如，对超螺旋质粒DNA或病毒DNA分子酶切时，所需要的酶量比对线性DNA分子酶切时所需要的酶量要高许多。;超螺旋质粒DNA分子; （六）反应缓冲液 ;核酸内切酶的缓冲液性质：;（七）酶的星号活性（star activity） 定义： 限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是