核酸的分析技术.ppt

一般流程 组织细胞破碎 一.核酸的提取 1. DNA提取 提取液浸提 酚/氯仿/异戊醇抽提 有机溶剂沉淀 溶解（TE) 纯 化 注意事项 一.核酸的提取 1. DNA提取 DNA的纯度可以满足下游操作的要求； 所得DNA必须完整； DNA应有足够的量； 操作程序简便，快捷，价格低廉，避免使用有毒试剂。 根据不同的实验材料和实验目的选用合适的实验方法！ 一.核酸的提取 1. DNA提取 SDS法 CTAB法 一.核酸的提取 2. 质粒提取 1-200 Kb; 共价闭合环状； 编码某些酶、抗生素、毒素； 易于操作。 质粒是独立于细菌染色体外能进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 常用作克隆或表达载体。 一.核酸的提取 2. 质粒提取 一般流程 菌体破碎 沉淀杂质 氯仿/异戊醇抽提 有机溶剂沉淀 溶解（TE) 碱裂解 SDS+醋酸钾 乙醇沉淀 一.核酸的提取 3. RNA提取 提取过程与DNA提取相似。 P103 严格避免RNase的作用！ 常用的方法：异硫氰酸胍 Trizol 二.核酸的检测 1. 核酸电泳 Gel electrophoresis 琼脂糖水平凝胶 聚丙烯酰胺垂直胶 二.核酸的检测 1. 核酸电泳 Gel electrophoresis 点样孔 核酸条带 M 二.核酸的检测 1. 核酸电泳 Gel electrophoresis 可以检测核酸的 完整性 纯度 分子量 二.核酸的检测 2. 紫外吸收 计算浓度：A260nm 检验纯度：A260/A280 三. PCR技术 聚合酶链式反应 PCR：polymerase chain reaction 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。 三. PCR技术 引物1 引物 （10-30 bp） 模板 DNA聚合酶 引物2 dNTP 根据已知信息设计引物序列 Mg2+ 三. PCR技术 热 变 性 退火 延 伸 I 三. PCR技术 热 变 性 退火 延 伸 I 三. PCR技术 延 伸 退 火 II 三. PCR技术 以此类推，呈几何级增长 一般进行25-35个扩增循环 DNA可扩增106~109倍 三. PCR技术 基因克隆； DNA文库筛选； 直接测序； 研究进化关系； 品种鉴定、转基因检测； 环境中致病菌和指示菌的检测等。 PCR 的应用