2010年引物软件.ppt

△G是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓而使PCR反应不能正常进行。 首先进行了引物自动有哪些信誉好的足球投注网站后， 即可通过Function菜单中Multiplex/Nested Primer命令进入巢式PCR引物设计，通过点中代表各个引物的三角号来选择引物，然后根据最下面的窗口中各个引物之间的二聚体形成情况来判断引物是否适合于作为巢式PCR的引物。 总的来说，Primer设计引物的经验为： 1、引物取分值高的； 2、两个引物的Tm值比较接近为好，温度为五六十度，不要高于七十度； 3、引物之间的距离200-1000比较常见； 4、Tm减去5度为退火温度； 5、引物和产物的Tm 值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。 6、最好能跨内含子，因为这样可以与基因组的序列分开来 （适用于RT-PCR） 简并引物的设计 利用primer premier5设计简并引物 （1）选择高度保守的序列来设计引物。如果可能的话，选择在基因家族内和不同种属间都保守的序列。 （2） 将参与多序列比对的序列中的任一条导入primer premier5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差数个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在primer premier5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 简并引物的在线设计：GeneFisher 主页：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/ Fasta格式的序列。或是上传。可以是核酸序列或蛋白序列，也可以单个或多个，如果是多个序列的话，会多一个多序列比对的步骤。 多序列比对的程序有两种，ClustalW 和 DIALIGN 作业 请描述MUS81基因特点，以word格式将其序列记录下来，其中CDS Exon以大写字母表示，其余为小写，并分别设计针对DNA和RNA的引物序列。 * 引物设计（Primer Design），酶切分析（Restriction Sites）和基序分析（Motif） 当一个基因被识别、其DNA序列被解读时，人们往往仍然无法 弄清相应的蛋白序列是什么。这是因为在没有其它信息的前提下，DNA序列可以按六种框架阅读和翻译 （每条链三种，对应三种不同的起始密码子）。阅读框的次序（+1,+2, +3,-1,-2,-3)。 2、实例分析：VEGFA的引物设计 2.1 确定目的基因序列 （1）/ 基因特点描述 （2）查找人VEGFA基因的第4个外显子的序列 事实上，在NCBI有很多种办法可以确定某个基因的外显子或者内含子，当然还有UTR区域。通过Blast是一种办法，但不够直观，需要判断的条件要多一些，经验也需要多一些。如果条件允许的话，我们可以借助其它一些专门的软件,让事情变得容易。 今天我们来介绍NCBI的其中一个软件，Splign Splign - is a utility for computing cDNA-to-Genomic alignments based on a variation of the Needleman-Wunsch algorithm combined with Blast for compartment detection and greater performance. Splign -通过mRNA或EST序列与所在的基因组序列比对，用于单个基因结构图（外显子内含子）显示, 用户每次只能提交一个基因序列。 GeneID 基因名会随着版本的升级而变化，当然，以前使用过的基因名也会保留。但该基因只对应一个GeneID，无论基因名如何改变，GeneID是唯一的。这个ID是非常重要的。 在RefSeq区域，我们将可以看到这个基因的参考序列，有mRNA和基因组的。这个区域不一定每个基因都有。NM_开头的序列都