QRT-PCR引物设计protocol.doc

QRT-PCR引物设计 要求： 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。 GC=30-80%； 应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）； 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在； 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响； 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的； 关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用； 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。跨内含子设计方案上下游引物分别在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA污染； 上游（A）或下游（B）或上下游引物（C）跨在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物不能从基因组DNA扩增,从而消除基因组DNA污染的影响（这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时注意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，8bp左右）。 ：1～285、1139～1205、1387～1447、1752～1896、2250～26301～285、～、～、～、～1-20、21-39同时完全匹配的基因（这种一般就是要扩增的基因，如果不是，那么就是非特异性扩增），其他的就不用考虑了。 查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件. 　　RTPrimerDB, 　　PrimerBank 　　Real Time PCR Primer Sets 　　如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考: 　　A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer() 　　B.DIY的软件Primer Express 　　C.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys )的服务方案,详细周到 　　D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: /products/probe_design.asp Exon Intron Exon FP RP Exon Intron Exon FP RP RP FP Exon Exon RP FP Exon Exon Exon Intron Intron Intron A B C