水稻突变体介绍及鉴定(很详细).doc

RMD水稻突变体基因型鉴定 原理： 2.1农杆菌介导的T-DNA 插入 农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤 和毛状根的发生。1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。 研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。 2.2 水稻Tos17 反转录转座子 创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以 DNA→ RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。这些反转录转座子只有在组织培养条件下才具备转座活性，其中Tos17 的转座活性最强，容易插入到富含基因的区域，因此可以直接用于创造插入失活的突变体库。利用含有Tos17 插入的水稻突变体库，可以进行突变性状的筛选， Tos17 反转录转座子正成为水稻功能基因组研究的一个有力工具。由于Tos17 反转录转座子为水稻内源的转座子，不需要进行转基因的过程，而且平均每株含有8 个Tos17 个拷贝，在正常情况下能够稳定遗传，因此Tos17 转座子突变体库是水稻功能基因组研究的一个有用资源。但也有研究表明，Tos17 在转座过程中存在几类转座热点，它容易插入到与抗病相关基因及蛋白激酶基因中。同时，Tos17 插入突变体库中观察到的突变体大约只有10%的突变是真正由于Tos17插入造成，另外的突变可能是由于组织培养过程中体细胞变异造成的，也有可能是组织培养激活了其它类的转座子发生转座所致。 水稻突变体库 3.1 水稻突变体库功能 由于T-DNA 在植物基因组中能稳定遗传，且拷贝数较低，对于突变体的遗传分析较容易。加之T-DNA 序列已知，一旦发现某个突变性状与T-DNA 共分离，则采用Tail-PCR、Inverse-PCR 或质粒拯救等方法很容易分离T-DNA 侧翼植物基因组序列。欲寻找某个基因的突变体，可以设计相应引物，采用Pool-PCR 的方法高通量地筛选突变体库。 另外，通过构建T-DNA 侧翼序列数据库，也可以大规模地寻找基因的突变体。 采用Tail-PCR 的方法分离T-DNA 插入突变体库的侧翼序列，有助于将T-DNA 插入位点在染色体上定位，寻找已知基因不同区段的突变体。此外，在T-DNA 区段构建Gene trap、Enhance trap 等元件后，还可通过检测报告基因来反映靶位点基因的表达模式。 3.2 遗传转化体系建立 农杆菌介导的转化主要依据 Hiei（1994）的水稻转化方法并有所改动。简单 流程如下： 菌株活化 ↓ 愈伤诱导 → 继代 → 预培养 → 侵染 → 共培养 → 抗性愈伤筛选 → 分化成苗→ 生根 →炼苗移栽 粳稻品种愈伤组织诱导/继代、预培养/共培养及筛选培养基用N6 培养基，分 化和生根用MS 培养基（其成分见附录1）。 3.3 突变体库转化植株的编号 为了便于突变体库产生的所有信息如植株种子、T-DNA 侧翼序列、报告基因 的表达模式等的统一管理，本研究中水稻突变体库的管理参照统一的数据库管理 和编号方法进行，如编号“01Z11AB90”，“01”表示该突变体产生的年份为2001 年；“Z11”表示转化的野生型亲本为中花11 号，中花15 的编号则为“Z15”，“AB”表示不同英文字的组合，代表不同的区号；“90”为阿拉伯数字编号，表示同一小区内的顺序号，编号范围为“01-96”。 3.4 水稻突变体发芽： 由于突变体发芽率会普遍降低，我们建议发芽的方法是：首先取10-20粒突变体种子，采用常规催芽的方法，若最后突变体发芽率高于60%的，即可将余下的种子进行常规催芽。如果发芽率偏低，我们建议您采用组培发芽（具体方法见附录2）。 4．