2015酶工程第2章酶的生产和纯化.ppt

为获得降解某种物质的产酶菌种，通常在该物质较丰富的地方寻找。 这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。 * * 胞外酶：在细胞内合成，分泌到细胞外发挥作用的酶。大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等） 胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，组成型酶一般是胞内酶 生长偶联型 （同步/中期合成型） 部分生长偶联型 (滞后合成型) 非生长偶联型(延续合成型) 2.2.2.3. 发酵条件对产酶的影响 A. 细胞活化与扩大培养 B. 培养基 C. pH值 D. 温度 E. 溶解氧 A. 细胞活化与扩大培养 菌种保藏：短期保藏、长期保藏 菌种活化：使用前接种于新鲜培养基上，培养以恢复细胞生命活动能力 扩大培养： 为保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化细胞要经一级至数级扩大培养 一般培养到细胞处于对数生长期为宜 采用孢子接种，则应培养至孢子成熟期 培养基的组成 碳源、氮源、水、无机盐、生长因子…… 根据微生物种类和生长条件确定培养基，同种细胞用于不同的酶生产，培养基成分不一样 生长、增殖、发酵、产酶等各阶段所需有区别 种子培养基和发酵培养基不一样 尽量减少培养基中对产酶的阻遏作用的物质 B. 培养基的影响 pH值对发酵产酶的影响 影响酶解离、电荷分布、构象和酶活、膜通透性、底物和产物的性质 改变酶之间的产量比例 产酶最适pH值：通常接近酶反应最适pH值，但一般不同于细胞生长的最适pH值 pH的变化：随细胞生长培养基pH会发生变化 pH的调控：培养基组分、比例、缓冲液、酸碱、补料 C. pH值的调节和控制 产酶温度 产酶温度往往低于生长温度 较低温度mRNA 稳定性较高，延续酶的合成 温度过低微生物代谢减慢，延长发酵周期 温度的变化 因细胞新陈代谢和热量扩散，温度不断变化 温度的调节 热水升温 冷水降温 D. 温度的调节和控制 KO2 —— 耗氧速率，指单位时间内单位体积培养液中细胞的耗氧量，(mmol O2)·h-·L-1 QO2 —— 细胞呼吸强度，指单位细胞量在单位时间内的耗氧量， (mmol O2)·h-1·(g DC)-1 Ccell —— 细胞浓度，单位体积培养液中细胞质量，(g DC)·L-1 E. 溶解氧的调节控制 Kd ——溶氧速率（溶氧系数），单位体积发酵液在单位时间溶解氧的量， (mmol O2)·h-1·L-1 当 Kd = KO2 时，培养液中溶氧量保持恒定 溶氧量的调节方法 通气量：增大通气量提高Kd O2 分压：提高O2 分压，可增加O2 溶解度，提高Kd 气液接触时间：延长接触时间，可增加O2 溶解量 气液接触面积：增大接触面积能提高Kd 培养液黏度：黏度大易产生泡沫，影响O2溶解 How to Improve Enzyme Output？ 2.2.3.1. 添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。 诱导物一般可以分为3类 酶的作用底物 酶的催化反应产物 作用底物的类似物 2.2.3 提高酶产量的措施? 2.2.3.2. 控制阻遏物的浓度 阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。 a.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。 b.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。 控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。 采用其他较难利用的碳源，如淀粉等 采用补料、分次流加碳源 添加一定量的环腺苷酸（cAMP） 对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 2.2.3.3. 添加表面活性剂 表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 2.2.3.4. 添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。 例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者