第五章 PCR技术原理.ppt

原位PCR的作用 鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。 60 操作步骤 ①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶. ②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K. ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置 .④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交. ⑤显微镜观察结果. 61 A.阳性对照 B.阴性对照 C.原位检测mRNA表达 61 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.? 逆转录酶 DNA聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 6）RT－PCR 反转录PCR 62 用途: 用于测定基因表达的强度 鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性 克隆mRNA的5’和3’末端序列 从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库 第五节? PCR 鉴定和诊断 1．普通诊断??? 通过 PCR 技术可以方便快捷地鉴定生物样品中是否含有特定的 DNA 序列，从而广泛用于物种或品系的鉴定，以及临床样本的诊断，病原物的污染鉴别和法医鉴定等。最简单的莫过于设计一对引物或几对引物，加以对照，通过 PCR 扩增来检测样品中的特定 DNA 的存在。 63 2．等位基因鉴定??? 在一个反应体系中使用一对以上引物的 PCR 就成为多重 PCR ，其结果产生多个 PCR 产物。通过比较扩增产物的大小和预期设计的大小，可以判断样品中含有哪些基因。多重 PCR 可用于等位基因的鉴定。若在一个品种中多个相似基因共存，可设计一系列引物对其进行鉴定。 64 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的PCR鉴定 1， 利用crylA基因特异性的混合引物对该菌株扩增出大小对应于crylAa、crylAb和crylAc基因的产物 3，该菌株中克隆到的cry218基因经鉴定属于crylAc基因 65 3．随机扩增多态性 DNA（random amplified polymorphic DNA , RAPD）??? 在常规 PCR 扩增中所用的引物一般是序列特异性的，是针对某个基因或 DNA 序列而设计的。其长度一般在 20 个核苷酸左右。随着引物的长度缩短，在基因组 DNA 上出现与之互补配对序列的几率进一步增加，用于 PCR 扩增后产物的数量也随之增加。当引物的长度缩短到一定程度后，单一引物就可以扩增出多个 DNA 产物。根据这一现象，美国杜邦公司的 Willianms 等人于 1990 年设计出一种建立随机扩增多态性 DNA ，即 RAPD 的方法。 66 用任意引物进行基因组指纹分析是检测DNA多态性的一种通用方法，对遗传学图谱绘制、系统发育学和种群生物学都很有用。 随机引物在一定条件下可产生DNA指纹，反应条件只要求引物能起始DNA合成，而不管此时引物和模板的配对是否完全。 有些引物起始的DNA合成发生在两条相对的DNA链上，其中最有效的那些反应在扩增过程中互相竞争而产生指纹，有的只有几个主要的PCR产物，有的则包括100多个 67 以成对混合方式使用10碱基引物 引物需经过筛选 4．扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism, AFLP)??? 是针对基因组 DNA 的限制性酶切片段进行选择性 PCR 扩增从而建立 DNA 指纹的技术。 selective restriction fragment polymorphic（SRFA）扩增指纹分析。由 Vos 于 1995 年所提出， 其作用原理为：首先将基因组 DNA 以两种限制性内切酶完全切割，之后再将合成的并与这两个限制酶产生的末端相对应的接头 (adapters) 与酶切 DNA 片段的两端连接。然后以含有接头序列和酶切位点序列的引物，对连接产物作 PCR 扩增。最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 PCR 产物分离，从而产生 DNA 指纹。