木聚糖酶的热稳定性以及最适pH值.doc

木聚糖酶的热稳定性以及最适pH值、温度的研究 冯焱白永胜黄增辉 摘要：木聚糖酶是一类内切糖苷酶酶系,同自然界中五碳糖的循环相联系,在能量循环中占有重要地位。试验通过采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法,在540 nm处用紫外分光仪测OD值,对某生物木聚糖酶进行研究,得出该木聚糖酶的最适pH值为4.2;分别在30～85℃测定木聚糖酶酶活,得该木聚糖酶的最适反应温度为50℃。同时发现,该酶的热稳定性较好、耐酸碱性好,木聚糖酶对pH值不敏感。 关键词：木聚糖酶;稳定性;最适;温度;pH值 中图分类号Q566+.5 冯焱,山西农业大学生命科学学院,030801,山西太谷。 白永胜、黄增辉,单位及通讯地址同第一作者。收稿日期:2007-06-18 木聚糖是一种多聚五碳糖,主要成分是D-木糖,是植物半纤维素的重要组成部分,它占植物碳水化合物总量的1/3,在自然界中是继纤维素之后的含量第二丰富的再生生物资源。木聚糖酶(E.C)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4木聚糖苷键的酶系。它对自然界中大量存在的半纤维素起着重要的作用,该酶广泛应用于食品、饲料添加剂等方面,已受到广泛的关注[1,2]。木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域,目前对于木聚糖酶的研究热点主要有以下几方面:①加深对木聚糖酶作用的分子机理的了解;②通过基因工程和蛋白质工程改良木聚糖酶的性质,研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品;③从天然微生物中筛选性质更为优良的木聚糖酶;④采用基因工程手段改良菌种,以获得更多的高产菌株;⑤优化发酵条件,进一步提高木聚糖酶的合成水平。现有的国内外文献关于酶活的测定介绍大多笼统,而且测定方法中各项指标都不统一,同类产品的酶活测定值没有可比性[3-6]。因此,本文就木聚糖酶酶活测定及pH值、温度等关键因素对酶活测定值的影响进行了进一步的研究,并提出木聚糖酶酶活的测定方法。 1材料与方法 1.l试验仪器 精密pH计(±0.01)、电子天平(d=1 mg)、刻度试管、试管架、移液枪(管)、烧杯、紫外分光光度计UV-1601、恒温水浴锅、冰箱、紫外检测器。 1.2试验材料 木聚糖酶酶制剂,由广东珠海市溢多利公司提供。 木糖、木聚糖、丙二醇、丙三醇 1.3试验试剂 0.2 mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为5.0)、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH值2.0～8.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)、1.0%木聚糖(Sigma X-0502)、蒸馏水。 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的配制[8,14]:取41.6 gNaOH溶于520 ml蒸馏水中,加3,5-二硝基水杨酸12 g溶解;另取酒石酸钠364 g溶解后,再加入苯酚(用50 ml溶解)和无水硫酸钠各10 g,溶解后将上述两种溶液合并、混匀,再加蒸馏水至2 000 ml混匀,移入棕色磨口瓶于暗处贮放1周后即成。 1.4酶活测定 1.4.1酶活单位定义 在37℃、pH值5.5条件下,每分钟产生1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活单位(U)。 1.4.2酶液制备 准确称取1.000 g该酶制剂,用0.2 mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为5.0)定容至500 ml,摇匀、静止提取,过滤后取滤液并稀释至适当倍数备用。 1.4.3还原糖标准曲线的绘制[7] 14.3.1吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液（2.4）4.0mL,加入DNS试剂（4.7）5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。 分别吸取木糖溶液（2.5）1.00mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL和7.00 mL，分别用缓冲溶液（2.4）定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL(做两个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液（2.4）和5.0mLDNS试剂（4.7）。.电磁振荡3s-5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。以标准空白为对照调零，在540nm处测定吸光度A值 以木糖浓度为Y轴，吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线 1.4.4酶活测定[7,8] 取25 ml具塞试管,加入1.0 ml木聚糖底物,于40℃保温5 min,然后精确加入1.0 ml酶液,准确反应30 min后加3.0 ml DNS,置沸水浴中5 min,再置冰浴中冷却。加10.0 ml去离子水,混匀后于540 nm处测OD值。空白管先加1.0 ml酶液和